英文名：Pichia pastoris receptive Preparation and Conversion Kit

储存条件： -20 ℃保存，未开封有效期 24 个月。
产品内容：

一、毕赤酵母感受态细胞的制备
1. 活化菌种。-80 ℃保存的菌种在固体 YPD 培养基平板上划线，30 ℃培养 2-4 天。
2. 选取酵母菌落接种到 10 mL 液体 YPD 培养基中，30 ℃摇床过夜培养后将培养物按 1%的接种量接种到
100 mL 液体 YPD 培养基中三角瓶中培养至 OD 值为 0.6-1.0。
注：每 10 mL 菌液可用于一次转化。以下操作步骤适用于 10 mL 菌液。
3. 3,000 rpm 离心 3 min 收集菌体沉淀。
4. 加入 5 mL B1 溶液重悬菌体，3,000 rpm 离心 3 min 收集菌体沉淀。
5. 再加入 200 μL B1 溶液重悬菌体，转移到无菌 1.5 mL 离心管，即为制备好的感受态细胞，可直接用于转化或冻存备用。
6. 制备好的感受态细胞需缓慢冷冻后，再置于-80 ℃冰箱长期保存。将感受态细胞放入程序降温盒，或用多层纸包裹放入泡沫盒中，先置于-80 ℃冰箱过夜后，再取出感受态置于-80 ℃冰箱，可保存半年。使用前冰上解冻或直接用于转化。
注：缓慢冷冻会保证良好的转化效率。扩大酵母菌培养体积，相应增加冻存液的使用量，可以一次性制备多只毕赤酵母感受态细胞。
二、毕赤酵母转化
1. 取 0.1-5 μg 质粒 DNA（线性化质粒加入量 5-50 μg）和 10 μL 预变性 Carrier DNA 加入到未融化的感受
态细胞上，置于 30 ℃水浴，每隔 15 s 颠倒混匀，直至感受态细胞刚好完全融化。（融化后及时取出）
2. 加入 1.4 mL B2 溶液颠倒混匀。30 ℃水浴 60 min。
3. 3,000 rpm 离心 3 min 弃上清留菌体沉淀，加入 1 mL B3 溶液重悬菌体。
4. 3,000 rpm 离心 3 min 弃上清留菌体沉淀，加入 100 μL B3 溶液重悬菌体。
5. 将 100 μL 菌液全部涂布到相应的平板培养基，30 ℃恒温培养 3-5 天，直至平板出现酵母克隆。
注意事项：初次使用 Carrier DNA，请把装有 Carrier DNA 的管子在沸水中煮沸 5 min，然后立即放在冰上，
用后放在-20 ℃储存备用。下次使用前请于冰上解冻 Carrier DNA。反复冻融 3-5 次后需重新变性 Carrier
DNA。