英文名：Geneticin 418 Solution(100mg/mL)

储存条件:-20℃

关于 G418
G418 Sulfate（G418 硫酸盐），也称作 Geneticin（遗传霉素），是一种结构类似于庆大霉素B1（Gentamycin B1）的氨基糖苷类抗生素，通过影响 80S 核糖体功能和阻断延伸步骤来干扰蛋白合成，对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、高等植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。其抗性基因（主要为 neo 基因）位于转座子 Tn601（903）或 Tn5（来源于细菌），但是可以在真核细胞中表达。通过基因重组技术将这些抗性基因导入细胞，使其获得对 G418 的耐药性，从而用来筛选和维持培养携带抗性基因的原核或者真核细胞。
哺乳动物细胞中，当抗性基因 neo 被整合进真核细胞基因组后，使其编码表达氨基糖苷磷酸转移酶（amino-glycoside 3’-phosphotransferase，APH(3)II）。此酶通过共价修饰G418 的氨基或羟基功能，抑制抗生素-核糖体间的相互作用，从而使得抗生素失活。这一特性赋予细胞产生抗性。稳转细胞株筛选实验，需要建立杀灭曲线（剂量反应曲线）确定杀死无抗性细胞的 有效浓度。
植物细胞中，通过转染携带 nptII 基因的抗性质粒孵育其抗性。nptII 基因也能编码表达氨基糖苷磷酸转移酶，这个酶使得多种抗生素丧失活性，包括 G418，卡那霉素和巴龙霉素。
使用方法
1. G418 储存液的配制（50 mg/mL，活性浓度）
1、活力单位的换算
根据公式换算：（1000/A0）×A1=A2，其中 A0是 G418 的活力值（Potency），因批次而异，可见批次对应的质检报告，或者瓶子上的标签。A1是想配制的活性 G418 浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。
例如：G418 活力值为：750 μg/mg，要配制 50 mg/mL 的 G418 活性浓度，则实际要配制的粉末浓度为 1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。如果配制 10 mL 的 G418 储存液（活性浓度，50 mg/mL），则需要称取 663.3 mg 粉末。
2、除菌和保存
根据上述换算得到的实际粉末称重，加入 10 mL 无菌去离子水内使其完全溶解。0.22 μm过滤，除菌后分装放到-20℃冻存，1 年稳定。
注：不建议使用液体培养基、氯化钠溶液、磷酸盐溶液，或者有机溶剂来制备储存液。
2.常用筛选浓度通常情况，哺乳动物细胞筛选范围 200-2000 μg/mL；植物细胞：10-100 μg/mL；酵母细胞：500-1000 μg/mL。
刚开始筛选转化子需要高浓度的 G418，后续用较低浓度的 G418 维持培养。生长条件、细胞类型、环境因素都可能影响 G418 的用量，因此建议新建实验体系通过杀灭曲线（killcurve），即剂量反应性曲线，来确定 筛选浓度。
不同细胞类型使用 G418 筛选使用的浓度：

3.杀灭曲线的建立
通常情况，哺乳动物细胞筛选范围 200-2000 μg/mL；植物细胞：10-100 μg/mL；酵母细胞：500-1000 μg/mL。
为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株，需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素 浓度，可通过建立杀灭曲线（剂量反应曲线）来实现，至少选择 6 个浓度。处理分裂期的细胞时 G418 的活性 ，因此在添加 G418 之前需要让细胞培养一段时间。
1、按照 20-25%的细胞密度将未转化的细胞铺在合适的培养板上，37℃，CO2过夜培养（需要更高密度，可增加接种量）。
2、根据细胞类型，设定合适的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例，可设定 50，100，250，500，750，1000μg/mL。
3、第 2 天换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基，每个浓度做三个平行孔。
4、接下来每 3-4 天更换新的含药物培养基。5、按照每 2 天进行活细胞计数，来确定杀灭未转染细胞的恰当浓度。通常 7-10 天内能够杀死绝大多数细胞的 浓度为筛选用的工作浓度。
稳定转染细胞的筛选
1、转染 48 h 后，用含有适当浓度的 G418 筛选培养基来传代细胞（直接传代或者稀释后传代）。
注：细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果 。则当细胞过于稠密，其效率会降低， 将细胞稀释至丰度低于 25%。
2、每隔 3-4 天更换含有药物的筛选培养液。
3、筛选 7 天后观察并评估细胞克隆（集落）的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这取决于宿主细胞类型，转染，以及筛选效果。
4、挑取并转移 5-10 个抗性克隆于 35 mm 细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养 7 天。
5、后续更换正常培养基培养即可。
注意事项
1、G418 不可高压灭菌；
2、G418 不要和其他的抗生素/抗 真 菌剂（如青霉素/链霉素）共同使用，因为它们是 G418的竞争性抑制剂。其它的抗生素会产生交叉活性。
3、配制 G418 溶液时，要换算不同批次 G418 的活力值（potency），从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。
4、加入 G418 的培养体系，未转染的细胞未被杀死，可能因为药物浓度过低，或者细胞密度过高。快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞，更容易被杀死。添加抗生素 5-7 天后可能才会杀死对照细胞（未转染），转染细胞（抗性克隆子）的克隆需要 10-14 天形成。
5、加入致死剂量的 G418，细胞可能还会继续分裂 2-3 次。G418 的药效通常在 2 天后才变得明显。
6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。