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G-418储存液(100mg/mL)
  • 品牌:LMAI Bio
  • 产地:中国/上海
  • 型号:2×1mL
  • 货号:LM83941-2×1mL
  • 价格: ¥288/毫升
  • 发布日期: 2023-02-02
  • 更新日期: 2024-03-04
产品详请
产地 中国/上海
保存条件 -20℃
品牌 LMAI Bio
货号 LM83941-2×1mL
是否是肿瘤细胞
规格 2×1mL
用途范围 本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途! 以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。
纯度 99%
是否进口
G-418储存液(100mg/mL)

英文名:Geneticin 418 Solution(100mg/mL)

储存条件:-20℃

关于 G418
G418 Sulfate(G418 硫酸盐),也称作 Geneticin(遗传霉素),是一种结构类似于庆大霉素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷类抗生素,通过影响 80S 核糖体功能和阻断延伸步骤来干扰蛋白合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、高等植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。其抗性基因(主要为 neo 基因)位于转座子 Tn601(903)或 Tn5(来源于细菌),但是可以在真核细胞中表达。通过基因重组技术将这些抗性基因导入细胞,使其获得对 G418 的耐药性,从而用来筛选和维持培养携带抗性基因的原核或者真核细胞。
哺乳动物细胞中,当抗性基因 neo 被整合进真核细胞基因组后,使其编码表达氨基糖苷磷酸转移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase,APH(3)II)。此酶通过共价修饰G418 的氨基或羟基功能,抑制抗生素-核糖体间的相互作用,从而使得抗生素失活。这一特性赋予细胞产生抗性。稳转细胞株筛选实验,需要建立杀灭曲线(剂量反应曲线)确定杀死无抗性细胞的 有效浓度。
植物细胞中,通过转染携带 nptII 基因的抗性质粒孵育其抗性。nptII 基因也能编码表达氨基糖苷磷酸转移酶,这个酶使得多种抗生素丧失活性,包括 G418,卡那霉素和巴龙霉素。
使用方法
1. G418 储存液的配制(50 mg/mL,活性浓度)
1、活力单位的换算
根据公式换算:(1000/A0)×A1=A2,其中 A0是 G418 的活力值(Potency),因批次而异,可见批次对应的质检报告,或者瓶子上的标签。A1是想配制的活性 G418 浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。
例如:G418 活力值为:750 μg/mg,要配制 50 mg/mL 的 G418 活性浓度,则实际要配制的粉末浓度为 1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。如果配制 10 mL 的 G418 储存液(活性浓度,50 mg/mL),则需要称取 663.3 mg 粉末。
2、除菌和保存
根据上述换算得到的实际粉末称重,加入 10 mL 无菌去离子水内使其完全溶解。0.22 μm过滤,除菌后分装放到-20℃冻存,1 年稳定。
注:不建议使用液体培养基、氯化钠溶液、磷酸盐溶液,或者有机溶剂来制备储存液。
2.常用筛选浓度通常情况,哺乳动物细胞筛选范围 200-2000 μg/mL;植物细胞:10-100 μg/mL;酵母细胞:500-1000 μg/mL。
刚开始筛选转化子需要高浓度的 G418,后续用较低浓度的 G418 维持培养。生长条件、细胞类型、环境因素都可能影响 G418 的用量,因此建议新建实验体系通过杀灭曲线(killcurve),即剂量反应性曲线,来确定 筛选浓度。
不同细胞类型使用 G418 筛选使用的浓度
2023020205043599497

3.杀灭曲线的建立
通常情况,哺乳动物细胞筛选范围 200-2000 μg/mL;植物细胞:10-100 μg/mL;酵母细胞:500-1000 μg/mL。
为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株,需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素 浓度,可通过建立杀灭曲线(剂量反应曲线)来实现,至少选择 6 个浓度。处理分裂期的细胞时 G418 的活性 ,因此在添加 G418 之前需要让细胞培养一段时间。
1、按照 20-25%的细胞密度将未转化的细胞铺在合适的培养板上,37℃,CO2过夜培养(需要更高密度,可增加接种量)。
2、根据细胞类型,设定合适的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例,可设定 50,100,250,500,750,1000μg/mL。
3、第 2 天换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基,每个浓度做三个平行孔。
4、接下来每 3-4 天更换新的含药物培养基。5、按照每 2 天进行活细胞计数,来确定杀灭未转染细胞的恰当浓度。通常 7-10 天内能够杀死绝大多数细胞的 浓度为筛选用的工作浓度。
稳定转染细胞的筛选
1、转染 48 h 后,用含有适当浓度的 G418 筛选培养基来传代细胞(直接传代或者稀释后传代)。
注:细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果 。则当细胞过于稠密,其效率会降低, 将细胞稀释至丰度低于 25%。
2、每隔 3-4 天更换含有药物的筛选培养液。
3、筛选 7 天后观察并评估细胞克隆(集落)的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间,这取决于宿主细胞类型,转染,以及筛选效果。
4、挑取并转移 5-10 个抗性克隆于 35 mm 细胞培养板,继续用含药物的筛选培养液维持培养 7 天。
5、后续更换正常培养基培养即可。
注意事项
1、G418 不可高压灭菌;
2、G418 不要和其他的抗生素/抗 真 菌剂(如青霉素/链霉素)共同使用,因为它们是 G418的竞争性抑制剂。其它的抗生素会产生交叉活性。
3、配制 G418 溶液时,要换算不同批次 G418 的活力值(potency),从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。
4、加入 G418 的培养体系,未转染的细胞未被杀死,可能因为药物浓度过低,或者细胞密度过高。快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞,更容易被杀死。添加抗生素 5-7 天后可能才会杀死对照细胞(未转染),转染细胞(抗性克隆子)的克隆需要 10-14 天形成。
5、加入致死剂量的 G418,细胞可能还会继续分裂 2-3 次。G418 的药效通常在 2 天后才变得明显。
6、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。
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