海藻糖含量测试盒/微量法说明书

测定意义：

海藻糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。由于海藻糖具有独特的不同于其他碳水化合物的生物学特性，能在干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等恶劣环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害。

测定原理：

蒽酮比色法。具有灵敏度高﹑简便快捷﹑适用于微量样品的测定等优点。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板﹑研钵、浓硫酸（不允许快递）和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 100ml×1 瓶，4℃保存；
试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存；
海藻糖提取：
1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复 30 次），室温静置 45min，振荡 3~5 次，冷却后，8000g，25℃离心 10min，取上清。

2、组织的处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液），冰浴匀浆，室温静置 45min，振荡 3~5 次，冷却后，8000g，25℃离心 10min，取上清。
3、血清（浆）的处理：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议取 0.1mL血清（浆）加入 1mL 提取液），冰浴匀浆，室温静置 45min，振荡 3~5 次，冷却后，8000g，25℃离心10min，取上清。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 620nm，蒸馏水调零。
2、 调节水浴锅至 95 度。
3、工作液的配制：临用前在试剂一中加入 3.75mL 蒸馏水后，缓慢加入 21.25mL 浓硫酸，不断搅拌，充分溶解，待用；用不完的试剂 4℃保存一周；
4、样本测定：取 60μL 样本和 240μL 工作液至 EP 管中，95 度水浴 10 min（盖紧，防止水分散失），自然冷却至室温，取 200uL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，在 620 nm 波长下记录测定吸光度值 A。
注意：由于工作液具有强腐蚀性，请谨慎操作。
若吸光值大于 1，请将样本用提取液稀释后再测定，计算公式中乘以相应的稀释倍数。
海藻糖含量计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 8.8976x+0.0729；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。  
2、按样本鲜重计算：
海藻糖含量(mg/g 鲜重)= [V1×(A -0.0729)÷8.8976]÷(W×V1÷V2)=0.112×(A -0.0729) ÷W。
3、按样本蛋白浓度计算：
海藻糖含量(mg/mg prot)= [V1×(A -0.0729) ÷8.8976]÷(V1×Cpr)=0.112×(A -0.0729) ÷Cpr。
4、按细菌或细胞密度计算：
海藻糖含量(μg/104 cell)=[1000 ×V1 ×(A -0.0729) ÷8.8976]÷(500 ×V1÷V2)=0.224 ×(A-0.0729)
5、血清（浆）海藻糖含量计算
海 藻 糖 含 量 （ mg/mL ） ＝ [V1 × (A -0.0729 ） ÷ 8.8976 ) ÷ (V3 × V1 ÷ V2)=1.12 × (A -0.0729) 1000 ：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，60μL=0.06mL；V2：加入提取液总体积 1mL；；V3：加入血清（浆体积），0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 4.4488x+0.0729；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。
2、按样本鲜重计算：
海藻糖含量(mg/g 鲜重)=[ V1×(A -0.0729)÷4.4488]÷(W×V1÷V2)=0.224×(A -0.0729) ÷W。
3、按样本蛋白浓度计算：
海藻糖含量(mg/mg prot)= [V1×(A -0.0729)÷4.4488]÷(V1×Cpr)=0.224×(A -0.0729) ÷Cpr。
4、按细菌或细胞密度计算：
海藻糖含量(μg/104cell)=[1000×V1×(A-0.0729)÷4.4488]÷(500×V1÷V2)=0.448×(A -0.0729) 5、血清（浆）  

海藻糖含量计算
海藻糖含量(mg/mL)=[V1×(A -0.0729）÷4.4488 )÷(V3×V1÷V2)=2.24×(A -0.0729)
1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，60μL=0.06mL；V2：加入提取液总体积 1mL；；V3：加入血清（浆体积），0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
注意： 检测限为 10μg/g 鲜重或 0.1μg/ mg prot

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。