顺乌头酸酶(ACO)测试盒/分光光度法说明书

测定意义：

顺乌头酸酶（aconitase），三羧酸循环中的酶，催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由β碳原子转移到α碳原子上，生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备。

测定原理：

ACO 催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将 NAD+ 还原生成 NADH，导致 340nm 处光吸收上升。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：50mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：10mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：1mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加 3mL 蒸馏水充分溶解；现配现用
试剂七：粉剂×1 支，4°保存；临用前加 36mL 试剂四充分溶解；
工作液：临用前在 36mL 试剂七中加入 3mL 蒸馏水、3mL 试剂四、3mL 试剂五、3mL 试剂六充分混匀

样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆转入离心管内 600g，4℃离心 5min。
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、上清液即胞浆提取物，可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。
5、在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。
测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）将工作液，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min；现配现用；若分次用将工作液分装后于-20°保存，一星期内可用。
（2）在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 样本 900μL 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。
ACO 活性计算
用石英比色皿测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。
ACO 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T=536×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。
ACO（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=108×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。 ACO 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.722×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.001 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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