柠檬酸合酶(CS)测试盒/微量法说明书

测定意义：

CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环 个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。

测定原理：

CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶 A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的 DTNB 转变成黄色的 TNB，在 412nm 处有特征吸光值。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制：
试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 1.5mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 28mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 1.2mL 蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；

样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
①称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
②将匀浆 600g，4℃离心 5min。
③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
④上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS（此步可选做）。
⑤在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CS 测定。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）在试剂五中加入 0.6mL 无水乙醇和 13mL 试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（2）测定管：在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、220μL 试剂五和 10μL 试剂六，混匀，37℃反应 15min 后立即测定吸光值 A1。
（3）对照管：在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、220μL 试剂四和 10μL 试剂六，混匀，37℃反应 15min 后立即测定吸光值 A2。（4）计算 ΔA=A1-A2，每个测定管设一个对照管。
CS 活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。  
（2）按样本鲜重
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W× V 样÷V 样总）÷T=23.8×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。CS（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.0475×ΔA V 反总：反应体系总体积，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=235.3×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V 样÷V 样总）÷T=47.5×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。CS（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.095×ΔA V 反总：反应体系总体积，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，15 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

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