类黄酮糖基转移酶(UFGT)测试盒/分光光度法说明书

测定意义：

类黄酮是植物次生代谢产物，糖基化是类黄酮基本结构形成的最主要的修饰反应之一，提高了类黄酮苷元的化学稳定性，这一过程主要由类黄酮糖基转移酶催化的，使类黄酮-OH 与 UDPG 反应，是黄酮合成途径中的关键酶。

测定原理：

类黄酮糖基转移酶催化花青素与尿苷二磷酸葡萄糖反应产生花青苷，主要以矢车菊素 3-葡萄糖苷（C3G）形式存在，用 HPLC 检测产物可反映类黄酮糖基转移酶的酶活性。
自备实验用品及仪器：
天平、研砵、离心机、恒温水浴锅、100 目筛、高校液相色谱、针头过滤器（水系、0.22μm）、滤膜（水系、0.45μm）、耐水 C18 柱（4.6×250mm）、样品瓶、甲酸、甲醇（色谱级）、超纯水
试剂组成和配制：
提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加全部试剂三溶解。
试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 8mL×1 瓶，4℃保存。
标准品：标准品×1 支，-20℃保存。
样本处理：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：2~5 的比例（建议称取约 0.5g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
实验前的准备工作：
1、检测产物制备

2、将 500 mL 超纯水和 500 mL 甲醇用 0.45 μm 的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：蒸馏水用水系滤膜抽滤，甲醇用有机系滤膜抽滤）。
3、流动相的配制：流动相 A 为 1.6%甲酸水溶液； 流动相 B 为 1.6%甲酸甲醇溶液。
4、将配好的流动相超声 30 分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。
5、标准品的配制：
在标准品中加入 1mL 甲醇，配成 5μmol /mL 母液，将母液用甲醇分别稀释成 2μmol/mL ，1μmol/mL 、0.5μmol/mL 、0.25μmol/mL、0.125μmol/mL 的标准品溶液。针头式过滤器过滤后待测。
测定操作步骤
1. 开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量 10 μL，梯度洗脱为 0~5min，85%A+15%B; 5~10min ， 85%A+15%B; 10~30min ， 80%A+20%B; 30~30.1min ， 60%A+40%B; 30.1~40min ，0%A+ B。流速 1mL/min，柱温 30℃，走样时间为 50min，检测波长 530nm，设置完毕保存方法组。
2.初始设置流动相 A=85%，流动相 B=15%，流速 1 mL/min，待基线稳定后开始加样。
3.加入标准品 10 μL，在 50min 内可分离 C3G，C3G 的保留时间在 25min 左右，（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的 C3G 标准品的峰面积。
4. 加入样品 10 μL，在相应保留时间处检测 C3G 的峰面积。
酶活计算：
1. 以标准品浓度（μmol/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标计算 C3G 标准曲线。将样品峰面积代入标准曲线，计算样品 C3G 含量。
2. 酶活单位定义：
A． 每毫克组织蛋白每分钟催化反应产生 1μmolC3G 定义为一个酶活单位。
UFGT 活性（μmol/min/mg prot）= C×V 反总÷（V 样×Cpr）÷ T =0.117×C÷Cpr
B． 每克组织每分钟催化反应产生 1μmolC3G 定义为一个酶活单位。
UFGT 活性（μmol/min/g 鲜重）= C×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷ T =0.117×C÷W
C：C3G 浓度，μmol/mL ；V 反总：反应总体积，0.35mL；V 样：加入样本量，0.1mL，V 样总：加入提取液体积，1mL，Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g，T：反应时间，min
注意事项：
1、 流速由小到大调节，避免柱压过大。
2、 使用完毕时，先用 50%的甲醇水溶液洗色谱柱 45min，再用纯甲醇冲洗色谱柱 30min。
3、 标准品的稀释倍数要根据样品中 C3G 浓度确定，样品中 C3G 的峰面积必须落在不同浓度的 C3G 标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。

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