植物花色苷测试盒/微量法说明书

测定意义：

花色苷是一类易溶于极性溶剂的天然色素，属黄酮类化合物。花色苷广泛存在于植物的根、茎、叶、花和果实中，使其呈现由红到紫等不同颜色，是植物主要的呈色物质。

测定原理：

采用 pH 示差法测定花色苷含量，当 pH 为 1.0 时花色苷在 530nm 处有 吸收峰,而当 pH 为 4.5 时,花色苷转变为无色查尔酮形式,在 530 处无吸收峰, 利用此特性分别测定在不同 pH 下的 530nm 和700nm 处的吸光度值。pH 示差法减少了溶液 pH 和溶剂差异的影响，排除了其他非花色苷类物质对检测结果的干扰。
需自备的仪器和用品：
酶标仪、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、超声波清洗器、研钵和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 100 mL× 1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 20 mL× 1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 20 mL × 1 瓶，4℃保存；
花色苷的提取：
按照样品质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 样品，加入 1mL 提取液），充分匀浆后转移到 EP 管中，提取液定容至 1 mL，盖紧后超声波提取 2 h，8000 g，常温离心 10 min，取上清液待测。
测定步骤：
1、酶标仪预热 30min 以上；试剂一和试剂二 25℃（室温）预热 10min 以上；
2、取 20 μL 上清液和 180 μL 试剂一（相当于稀释 10 倍），40℃水浴 20min，分别测定 530nm 和 700nm处的吸光值，分别记为 A1 和 A2。
3、 取 20 μL 上清液和 180 μL 试剂二（相当于稀释 10 倍），40℃水浴 20min，分别测定 530nm 和 700nm处的吸光值，分别记为 A3 和 A4。4、 计算△A=(A1-A2)-(A3-A4)
注意：如果 A1 大于 1，可以适当加大稀释倍数，保证总体积 200 μL 不变，如 10 μL 上清液和 190 μL 试剂一（相当于稀释 20 倍）；如果 A1 小于 0.1，可以适当缩小稀释倍数，保证总体积不变，如 100 μL 上清液和 100μL 试剂一（相当于稀释 2 倍），使 A1 保持在 0.1~1 范围内，可提高检测灵敏度；同样调整上清液和试剂二体积比例；计算时以实际稀释倍数代入下述公式中。
花色苷含量计算：
花色苷含量（μg/g 鲜重）=[ΔA×V÷（ε×d）×M×F×106]÷W=33.4×ΔA× F÷W
V：提取液体积，1×10-3L；ε：花色苷的摩尔消光系数，2.69×104 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；M：花色苷的相对分子质量：449.2g/mol；F：稀释倍数；106：1g=106μg；W：样本干重：g。A 线性范围为 0.005-0.5。

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