二氢黄酮醇还原酶(DFR)测试盒/微量法说明书

测定意义：

二氢黄酮醇还原酶是类黄酮合成途径中的一个关键酶，在决定植物的花色、叶色、果色和其他经济器官的色泽及其营养品质方面起着重要作用。

测定原理：

二氢黄酮醇还原酶作用于二氢槲皮素产生儿茶素，可与香草醛缩合形成红色化合物，在 500nm 处有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品
研钵、低温离心机、震荡仪、氮吹仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、水浴锅、无水乙醇、乙酸乙酯、浓盐酸。
测定操作表
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 500nm。
2、 操作表

试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 12mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 1.5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存，临用前加 2mL 蒸馏水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃避光保存，临用前加入 30mL 浓盐酸溶解待用；用不完的试剂 4℃ 避光保存。
酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
酶活性计算公式
a． 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.0184x+0.0002，R2=0.999
（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在 30℃，pH7.5 条件下，每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生 1mmol 儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR 活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0184×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T÷2 = 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在 30℃，pH7.5 条件下，每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生 1mmol 儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR 活性（mmol/min/g 鲜重）= （△A-0.0002）÷0.0184×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T÷2 = 9.06×（△A-0.0002）÷W
V 反总：反应总体积，1mL；V 样：反应体系中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min
b．用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.0092x+0.0002，R2=0.999
（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在 30℃，pH7.5 条件下，每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生 1mmol 儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR 活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0092×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T÷2 = 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在 30℃，pH7.5 条件下，每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生 1mmol 儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR 活性（mmol/min/g 鲜重）= （△A-0.0002）÷0.0092×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T÷2 = 9.06×（△A-0.0002）÷W
V 反总：反应总体积，1mL；V 样：反应体系中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min

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