类黄酮糖基转移酶(UFGT)测试盒/微量法说明书

测定意义：

花色苷是一类易溶于极性溶剂的天然色素，属黄酮类化合物。花色苷广泛存在于植物的根、茎、叶、花和果实中，使其呈现由红到紫等不同颜色，是植物主要的呈色物质。类黄酮糖基转移酶（UDP-glycose flavonoidglycosyltransferase, UFGT）是花色苷合成过程的 一个酶，可以把不稳定的花色素催化成花色苷，在一定范围内，UFGT 活性与花色素苷的合成呈现正相关。

测定原理：

UFGT 催化 UDPG 与槲皮素生成 UDP；UDP 在丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶作用下，氧化 NADH 为 NAD+，NAD+生成速度与 UDP 含量成正比，通过 340nm 吸光度下降速度反映 UFGT 活性。
需自备的仪器和用品：
酶标仪、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存；临用前加入 20mL 试剂四溶解。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 100μL×1 管，4℃避光保存；
试剂四：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

样品测定的准备：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、在 EP 管中加入如下试剂

2、工作液配制：在试剂二中加入 20mL 试剂四溶解，再加入 20μL 试剂三，混匀待用。用不完的工作液分装后-20℃保存一个月，禁止反复冻融。
3、在 96 孔板中加入如下试剂

混匀，测定 340nm 下 1min 时吸光值 A1 与 6min 时吸光值 A2，ΔA=A1-A2。
UFGT 活力计算：
1、按照蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 UFGT 活力(nmol/min/mgprot)=ΔA×V 反总÷（ε×d）×109÷（V 样×Cpr）÷T×10=134×ΔA ÷Cpr
2、按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
UFGT 活力(nmol/min/g 鲜重)=ΔA×V 反总÷（ε×d）×109÷（W× V 样÷V 样总）÷T×10 =134×ΔA÷W
V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，240 min；10，稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；

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