4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)测试盒/微量法说明书

测定意义：

4CL 是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶，主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶 A 酯，是合成木质素与其他苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。

测定原理：

4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA，在 333nm 下测 4-香豆酸 CoA 生成速率，即可反映 4CL活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 25 mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；
粗酶液提取：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪 40℃预热 30min 以上，调节波长至 333nm，蒸馏水调零。
2、 准备 96 孔 UV 板一块（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光，检测波长小于 340nm 务必使用 UV 板）。
3、 样本测定
（1）在试剂二中加入 5mL 试剂一充分溶解混匀，置于 40℃水浴预热 10min；现配现用（配好后 24h 内用完）；
（2）对照管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂一，混匀，立即记录333nm 处 40℃反应 30min 后的吸光值 A1。
（3）测定管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂二，混匀，立即记录333nm 处 40℃反应 30min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。每个测定管设一个对照管。
4CL 活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：  
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。4CL（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算：
单位定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。
4CL（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=31.75×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.063×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：4-香豆酸辅酶 A 摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。4CL
（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=63.49×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。
4CL（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W×V 样÷V 样总) ÷T=63.49×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：  
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。
4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.127×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：4-香豆酸辅酶 A 摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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