NAD苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)测试盒/分光光度法说明书

测定意义：

MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中 MDH 是 TCA 循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH 分为NAD-依赖的 MDH 和 NADP-依赖的 MDH，细菌中通常只含有 NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH 分布于细胞质和线粒体中。

测定原理：

NAD-MDH 催化 NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸，导致 340nm 处光吸收下降。
 
需自备的仪器和用品： 
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。
 
试剂的组成和配制： 
试剂一、提取液 60 mL×1 瓶，在 4℃保存；
试剂二、液体 50 mL×1 瓶，在 4℃保存；
试剂三、粉剂×2 支，-20℃保存；临用前加入 300μL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四、粉剂×2 支，-20℃保存；临用前加入 300μL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
样本测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 1000~5000：1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤： 
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂二在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。
3、 操作表：

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 1min后的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2。
注意：若 A1-A2 大于 0.5，需将样本用提取液稀释，使 A1-A2 小于 0.5，可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
NAD-MDH 活力单位的计算：
1、血清（浆）NAD-MDH 活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=6430×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 NAD-MDH 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W× V 样÷V 样总）÷T =6430×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（2000×V 样÷V 样总）÷T=3.215×ΔA
V 反总：反应体系总体积，8×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；2000：细胞或细菌总数，2000 万。

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