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NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒/微量法
物品单位 价格 品牌
510 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:100管/96样
  • 货号:LM-892594S
  • 发布日期: 2022-11-25
  • 更新日期: 2022-11-25
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-892594S
用途范围 NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。
纯度 99%
CAS编号
规格 100管/96样
是否进口

NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒/微量法说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中 MDH 是 TCA 循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH 分为NAD-依赖的 MDH 和 NADP-依赖的 MDH, NADP-MDH 主要存在于真核细胞中。


测定原理:

NADP-MDH 催化 NADPH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致 340nm 处光吸收下降。

需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制:
试剂一、提取液 100 mL×1 瓶,在 4℃保存;
试剂二、液体 20 mL×1 瓶,在 4℃保存;
试剂三、粉剂×1 瓶,-20℃保存;

样本测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、检测工作液的配制:用时在试剂三中加入 19mL 试剂二和 0.5mL 蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
3、测定前将检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 样本和 195μL 工作液,混匀后立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。
注意:若 A1-A2 大于 0.5,需将酶液用提取液稀释,使 A1-A2 小于 0.5,可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
NADP-MDH 活力单位的计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)NADP-MDH 活力的计算
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=6430×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 NADP-MDH 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T =6430×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×500)÷T=12.86×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.005 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)NADP-MDH 活力的计算
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=12860×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 NADP-MDH 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T =12860×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=25.72×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.005 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500 万。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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