NADH氧化酶(NOX)测试盒/微量法说明书

测定意义：

NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将 NADH 氧化为 NAD。该酶不仅参与 NAD 的再生，而且与免疫反应密切相关。

测定原理：

NOX 能够将 NADH 氧化为 NAD，NADH 的氧化与 2,6 二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的 DCPIP被还原为无色的 DCPIP，在 600nm 下测定蓝色 DCPIP 的还原速率计算出 NADH 氧化酶活性的大小。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、蒸馏水
 
试剂的组成和配制：
试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 1.5mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂四：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。
试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 5mL 蒸馏水，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
 
样本的前处理： 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心 10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 NOX（此步可选做）。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或
200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于 NOX 活性测定。
血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤： 
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 600nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）试剂四于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。
（2）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、200μL 试剂四和 40μL 试剂五，混匀，记录 600nm处 20s 时吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

NOX 活力单位的计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）NOX 活力的计算:
单位的定义：每 mL 血清（浆）在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mL）＝ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T=2500×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 NOX 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T=505×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/104 cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.25mL； V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500万。
b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下：
1、血清（浆）NOX 活力的计算:
单位的定义：每 mL 血清（浆）在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mL）＝ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T=5000×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 NOX 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/104 cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.005÷T=2.02×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.25mL； V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500万。

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