乙醇含量测试盒/分光光度法说明书

测定意义：

酒是含酒精（乙醇）饮料的统称，乙醇是酒的主要成分，是衡量酒质量的重要指标之一。我国是 上最早发明酿酒的国家，也是酒类产品消费大国，其消费量居 。因此，快速、准确测定酒中乙醇含量，对于确保酒的质量和保护消费者的健康具有重大意义。

测定原理：

乙醇在乙醇脱氢酶的催化下氧化脱氢生成乙醛，同时，NAD 被还原生成 NADH，NADH 在 1-mPMS 的作用下使 WST-8 显橙黄色，通过 450 nm 下测定吸光值变化可测得乙醇含量。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：液体 30 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 15 mL 试剂三充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：液体 20 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂四：液体 3mL×1 管， 4℃避光保存。

乙醇提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：蒸馏水体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 蒸馏水），进行匀浆，8000g，25℃离心 10min，取上清待测。
2. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：蒸馏水体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 蒸馏水），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）， 8000g，25℃离心 10min，取上清待测。3. 血清（浆）等液体样品：直接测定。
测定步骤：
1. 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 450nm。
2. 工作液的配制：临用前按照样本数量，按以下比例配制工作液

3. 样本测定
按下表加入如下试剂

混匀后记录 450nm 下测定初始吸光值 A1，和 37℃避光孵育 10min 后的吸光值 A2，计算△A=A2-A1。
乙醇含量计算：
标准条件下测定回归方程为 y = 0.0512x + 0.0055 R2 = 0.9991；x 为乙醇含量（μmol/mL），y 为吸光值差值△A。
1.按照血清（浆）体积计算
乙醇含量（μmol/mL）= (△A-0.0055)÷0.0512=19.5×(△A-0.0055)
2.按照样品质量计算
乙醇含量（μmol/g 鲜重）= [ (△A-0.0055)÷0.0512×V1]÷(W ×V1÷V2）=19.5×(△A-0.0055)÷W
3.按照细菌或细胞密度计算
乙醇含量（μmol/104 cell）= [ (△A-0.0055)÷0.0512×V1]÷（500×V1÷V2）=0.039×(△A-0.0055)
V1：加入反应体系中样本体积，0.2mL；V2：加入提取液体积，1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；
注意事项：
测定前取 1-2 个样做预实验，若△A﹥0.6 或乙醇含量﹥10μmol/mL，需将样本用蒸馏水稀释后再测定，以确保测定的准确性。
检测限：0.02μmol/mL。

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