乙醇脱氢酶(ADH)测试盒/微量法说明书

测定意义：

ADH 是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物 ADH 主要在肝脏生成，肝脏损伤导致 ADH 释放到血清中。血清 ADH 活性高低反映了肝 功 能是否异常。

测定原理：

ADH 催化 NADH 还原乙醛生成乙醇和 NAD+，NADH 在 340nm 处有吸收峰，而 NAD+没有；测定 340nm吸光度下降速率，来计算 ADH 活性。
自备仪器和用品：
研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，室温保存。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×2 瓶，－20℃保存，临用前每瓶加入 9mL 试剂二，现配现用。
试剂四：液体×1 支，4℃保存。
粗酶液提取：
1、 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
2、 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；16000g，4℃离心 20min，取上清液置冰上待测。
3、血清等液体：直接测定。
ADH 测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三在 25℃水浴中保温 30 min。
3. 在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μL 样本上清液、160μL 试剂三和 20μL 试剂四，迅速混匀后于340nm 测定吸光值变化，分别记录 15s 和 75s 时吸光值，分别记为 A1 和 A2。△A 测定管=A1-A2。
计算公式：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反总×109)÷(Cpr×V 样)÷T=1608×△A ÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (nmol/min/g 鲜重) =(△A÷ε÷d×V 反总×109)÷(W×V 样÷V 样总)÷T=1608×△A ÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每 104个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (nmol/min/104cell) = (△A÷ε÷d×V 反总×109) ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=1608×△A ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V 反总×109) ÷V 样÷T=1608×△A
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反总×109) ÷(Cpr×V 样)÷T=3215×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (nmol/min/g 鲜重) =(△A÷ε÷d×V 反总×109) ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=3215×△A÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每 104个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (nmol/min/104cell) =(△A÷ε÷d×V 反总×109) ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=3215×△A÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V 反总×109) ÷V 样÷T=3215×△A
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。

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