甲醛脱氢酶(FDH)测试盒/微量法说明书

测定意义：

甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物，对所有生物都具有很高毒性。甲醛脱氢酶作为含锌中等链醇脱氢酶（ADH）的家庭成员之一，广泛存在于原核和真核生物中，该酶能利用 NAD+作为辅酶，将有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途径中的关键酶。

测定原理：

甲醛脱氢酶催化甲醛和 NAD+产生 NADH，在 340nm 处的吸光值会增加，测定 340nm 处的吸光值变化，可计算得到甲醛脱氢酶的活性。
自备实验用品及仪器：
天平、离心机、酶标仪、96 孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 6mL 水溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1 支，4℃保存；临用前加入 1.5mL 水溶解待用。
试剂四：液体 1.5mL×1 支，4℃避光保存。
FDH 提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 20min。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 液体：直接检测。
测定操作表：
1、 酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm。
2、 操作表
在 96 孔板中加入如下试剂

混匀，于 340nm 下测定初始吸光值 A1 与 5min 后的吸光值 A2，△A=A2-A1。若样本数量较多，可将试剂按比例配成工作液使用。
FDH 酶活计算：
（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。
NADH 微摩尔消光系数，6.22×10-3 L/μmol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 反总：反应体系总体积，0.2mL；V 样：反应体系中样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T，反应时间，5min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

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