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肉桂醇脱氢酶(CAD)测试盒/微量法
物品单位 价格 品牌
1430 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:100管/96样
  • 货号:LM-876956S
  • 发布日期: 2022-11-23
  • 更新日期: 2022-11-23
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876956S
用途范围 CAD催化肉桂醇和NADP生成肉桂醛和NADPH,在340nm下测定NADPH生成速率,即可反映CAD活性。
纯度 99%
CAS编号
规格 100管/96样
是否进口

肉桂醇脱氢酶(CAD)测试盒/微量法说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

CAD 是木质素生物合成途径中的关键酶之一,是木质素单体合成反应中的 一步,催化多种不同的肉桂醛(香豆醛、芥子醛以及松柏醛等)生成与之相应的肉桂醇。该酶多存在于高等植物、酵母、菌类中,研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理,为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。

测定原理:

CAD 催化肉桂醇和 NADP 生成肉桂醛和 NADPH,在 340nm 下测定 NADPH 生成速率,即可反映 CAD 活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 25 mL×1 瓶, 4℃保存;
试剂二:粉剂×2 瓶,-20℃保存;
粗酶液提取:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)在试剂二中加入 10mL 试剂一充分溶解混匀,室温使用涡旋振荡仪振荡溶解 15min,如未溶解可适当延长振荡时间;置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min;现配现用(配好后 24h 内用完);
(2)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂二,混匀,立即记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。
CAD 活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.572×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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