肉桂醇脱氢酶(CAD)测试盒/微量法说明书

测定意义：

CAD 是木质素生物合成途径中的关键酶之一，是木质素单体合成反应中的 一步，催化多种不同的肉桂醛（香豆醛、芥子醛以及松柏醛等）生成与之相应的肉桂醇。该酶多存在于高等植物、酵母、菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。

测定原理：

CAD 催化肉桂醇和 NADP 生成肉桂醛和 NADPH，在 340nm 下测定 NADPH 生成速率，即可反映 CAD 活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 25 mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；
粗酶液提取：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）在试剂二中加入 10mL 试剂一充分溶解混匀，室温使用涡旋振荡仪振荡溶解 15min，如未溶解可适当延长振荡时间；置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用（配好后 24h 内用完）；
（2）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂二，混匀，立即记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
CAD 活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.572×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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