锰过氧化物酶(MnP)测试盒/分光光度法说明书

测定意义：

锰过氧化物酶（EC1.11.1.13）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，主要存在于担子菌中，属于木质素降解酶系，能有效的降解木质素及废水和土壤中比较难降解的氯化物，叠氮化合物、DTT，多环芳烃等。

测定原理：

锰过氧化物酶在 Mn2+存在的条件下，将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，在 465nm 有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器：
天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅。
试剂组成和配制 ：
试剂一：液体 75mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 11mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
酶液提取：
1. 组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 10min，取上清置于冰上待测。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 4℃，10000g离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体：直接检测。
测定操作：
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 465nm，蒸馏水调零。
2、 测定前将试剂一、二、三、四在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）放置 10min 以上。
3、 样本测定表

在 1 mL 玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录 465nm 下 30s 时的吸光值 A1 和 2min30s后的吸光值 A2。计算 ΔA＝A2-A1。
注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三、四按比例配成混合液，在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）放置 10min 以上，测定时加入 100μL 样本和 900μL 混合液测定。
酶活计算公式：
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=413×ΔA÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克样品每分钟氧化 1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性（nmol/min/g 鲜重）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×109] ÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 413×ΔA÷W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每 104个细胞每分钟氧化 1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109] ÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T= 413×ΔA÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升培养液每分钟氧化 1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T= 413×ΔA
ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，1×10-3L；V 样：反应中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min

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