亚铁氧化酶(HP)测试盒/微量法说明书

测定意义：

Hephaestin (HP)作为铜蓝蛋白的同系物,是近年来发现的铁转运蛋白亚铁氧化酶，HP 属亚铁氧化酶家族成员,具有亚铁氧化酶的活性,参与体内铁代谢。HP 的表达可受铁、铜及锌等金属离子的调节。HP 催化 Fe2+氧化生成 Fe3+，在介导铁的跨膜转运中有重要作用。

测定原理：

HP 催化 Fe2+氧化为 Fe3+，Fe2+和 ferrozine 反应显色，在 560 nm 下有特征吸光值。通过测定 Fe2+的减少速率可测得亚铁氧化酶的活性。
自备用品：
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 60 mL×1 瓶，4℃保存;
试剂二：液体 1.5 mL×1 瓶，4℃保存;
试剂三：液体 11 mL×1 瓶，4℃避光保存。
粗酶液提取：
按照组织质量（g）：水（mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 蒸馏水），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1. 酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至 560 nm。
2. 在 96 孔板中加入下列试剂

HP 活性计算:
标准曲线：y = 8.2135x - 0.0006，R2 = 0.9998；(x 为标准品浓度，μmol/mL；y 为吸光值 ΔA)
（1）按样本质量计算
单位定义：每 g 样本每分钟氧化 1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位。
HP（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V 总÷T ÷(W× V 样÷V 样总)× 1000 = 40.58×（△A+0.0006）÷W
（2）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 蛋白每分钟氧化 1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位。
HP（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V 总÷T ÷（Cpr×V 样） = 40.58×（△A+0.0006）÷Cpr
V 总：反应体系体积，0.1 mL；V 样：加入样本体积 0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；1000，μmol 到 nmol 的转换系数。

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