红霉素-N-脱甲基酶(ERND)测试盒/微量法说明书

测定意义：

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的酶系，在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物的代谢，具有重要作用。ERND 在 P450 酶系中相当于 CYP2B 亚型，与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B 具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解 毒作用，也可使某些药物经 CYP2B 代谢活化。

测定原理：

ERND 催化红霉素释放甲醛，通过 Nash 比色测定甲醛含量，即可计算出 ERND 活性。
自备仪器和用品：
普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水和冰。
试剂组成和配置：
试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 100mL 蒸馏水溶解。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加 1mL 蒸馏水，充分溶解。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 0.5mL 蒸馏水，充分溶解。
试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前，加蒸馏水 4.5mL 充分溶解。
试剂六：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂七：液体×1 瓶，4℃保存。
标准液：液体×1 瓶，-20℃保存。临用前取 1.5mL EP 管，加入 10μl 标准液，加 990μl 蒸馏水，混匀即为0.05 mmol/L 标准甲醛溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约 0.5g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心 30min，取上清液，转入超速离心管中。
2、粗制微粒体：100 000g，4℃，离心 60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃上清液。
4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL，充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 30 min。
3. 对照管：取 0.5mL EP 管，加入 10μL 粗酶液，170μL 试剂二，10μL 试剂三，10μL 蒸馏水，混匀后置于37℃水浴保温 30min；立即加入 35μL 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μL 试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取新的 EP 管，加入 100μL 上清液，100μL 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为 A 对照管。
4. 测定管：取 0.5mL EP 管，加入 10μL 粗酶液，170μL 试剂二，10μL 试剂三，10μL 试剂四，混匀后置于 37℃水浴保温 30min；立即加入 35μL 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μL 试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取新 EP 管，加入 100μL 上清液，100μL 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为 A 测定管。
5. 标准管：取 0.5mL EP 管，加入 100μL 标准品，100μL 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为 A 标准管。
注意：每个样品都需要做对照管。
ERND 活性计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按照蛋白浓度计算:
活性单位定义：37℃下，每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T= 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr。
(2). 按照样本质量计算:
活性单位定义：37℃下，每分钟每克样品催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
ERND 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（W×V 样）÷T= 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W
C 标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 标准品：100μL=1×10-4 L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=（50+850+50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量，g；V 样：加入粗酶液体积，10μL=0.01mL；T：催化反应时间（min），30min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1). 按照蛋白浓度计算:
活性单位定义：37℃下，每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T= 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr。
(2). 按照样本质量计算:
活性单位定义：37℃下，每分钟每克样品催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
ERND 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（W×V 样）÷T= 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W
C 标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 标准品：100μL=1×10-4 L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=（50+850+50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量，g；V 样：加入粗酶液体积，10μL=0.01mL； T：催化反应时间（min），30min。

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