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红霉素-N-脱甲基酶(ERND)测试盒/微量法
物品单位 价格 品牌
1430 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:100T/48S
  • 货号:LM-876796S
  • 发布日期: 2022-11-17
  • 更新日期: 2022-11-17
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876796S
用途范围 ERND催化红霉素释放甲醛,通过Nash比色测定甲醛含量,即可计算出ERND活性。
纯度 99%
CAS编号
规格 100T/48S
是否进口

红霉素-N-脱甲基酶(ERND)测试盒/微量法说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的酶系,在外源物质代谢中,尤其是药物和毒物的代谢,具有重要作用。ERND 在 P450 酶系中相当于 CYP2B 亚型,与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B 具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解 毒作用,也可使某些药物经 CYP2B 代谢活化。

测定原理:

ERND 催化红霉素释放甲醛,通过 Nash 比色测定甲醛含量,即可计算出 ERND 活性。
自备仪器和用品:
普通离心机,超速离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水和冰。
试剂组成和配置:
试剂一:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加 100mL 蒸馏水溶解。
试剂二:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1 管,4℃保存。临用前加 1mL 蒸馏水,充分溶解。
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加 0.5mL 蒸馏水,充分溶解。
试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前,加蒸馏水 4.5mL 充分溶解。
试剂六:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂七:液体×1 瓶,4℃保存。
标准液:液体×1 瓶,-20℃保存。临用前取 1.5mL EP 管,加入 10μl 标准液,加 990μl 蒸馏水,混匀即为0.05 mmol/L 标准甲醛溶液,4℃保存。
粗酶液提取:
1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约 0.5g 组织,加入 1mL 试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4℃离心 30min,取上清液,转入超速离心管中。
2、粗制微粒体:100 000g,4℃,离心 60min,弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质:向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g 离心 30min,弃上清液。
4、最终微粒体:向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL,充分震荡溶解,即粗酶液,待测。该待测液需当天使用。
测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min,调节波长到 412 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 30 min。
3. 对照管:取 0.5mL EP 管,加入 10μL 粗酶液,170μL 试剂二,10μL 试剂三,10μL 蒸馏水,混匀后置于37℃水浴保温 30min;立即加入 35μL 试剂五,混匀后置于冰浴中 5min;取出后加入 35μL 试剂六,混匀后室温静置 5min;室温 8000rpm 离心 5min;取新的 EP 管,加入 100μL 上清液,100μL 试剂七,混匀后 60℃水浴 10min,然后取出,用冷水冷却 5min,于 412nm 测定光吸收,记为 A 对照管。
4. 测定管:取 0.5mL EP 管,加入 10μL 粗酶液,170μL 试剂二,10μL 试剂三,10μL 试剂四,混匀后置于 37℃水浴保温 30min;立即加入 35μL 试剂五,混匀后置于冰浴中 5min;取出后加入 35μL 试剂六,混匀后室温静置 5min;室温 8000rpm 离心 5min;取新 EP 管,加入 100μL 上清液,100μL 试剂七,混匀后 60℃水浴 10min,然后取出,用冷水冷却 5min,于 412nm 测定光吸收,记为 A 测定管。
5. 标准管:取 0.5mL EP 管,加入 100μL 标准品,100μL 试剂七,混匀后 60℃水浴 10min,然后取出,用冷水冷却 5min,于 412nm 测定光吸收,记为 A 标准管。
注意:每个样品都需要做对照管。
ERND 活性计算公式:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按照蛋白浓度计算:
活性单位定义:37℃下,每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷(Cpr×V 样)÷T= 45×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷Cpr。
(2). 按照样本质量计算:
活性单位定义:37℃下,每分钟每克样品催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
ERND 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V 样)÷T= 45×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷W
C 标准品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V 标准品:100μL=1×10-4 L;稀释倍数:V 反总÷V 上清液=(50+850+50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒;W:样品质量,g;V 样:加入粗酶液体积,10μL=0.01mL;T:催化反应时间(min),30min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1). 按照蛋白浓度计算:
活性单位定义:37℃下,每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷(Cpr×V 样)÷T= 45×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷Cpr。
(2). 按照样本质量计算:
活性单位定义:37℃下,每分钟每克样品催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
ERND 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V 样)÷T= 45×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷W
C 标准品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V 标准品:100μL=1×10-4 L;稀释倍数:V 反总÷V 上清液=(50+850+50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒;W:样品质量,g;V 样:加入粗酶液体积,10μL=0.01mL; T:催化反应时间(min),30min。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。


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