NADPH-细胞色素C还原酶(NCR)测试盒/分光光度法说明书

测定意义：

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR 作为 P450 酶系的重要一员，催化氧化型 P450 还原再生。

测定原理：

NCR 催化 NADPH 还原氧化型细胞色素 c 生成还原型细胞色素 c，还原型细胞色素 c 在 550nm 处有特征吸收峰；通过测定 550nm 吸光度的增加速率，来计算 NCR 活性。
自备仪器和用品：
可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 100mL 蒸馏水充分溶解。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前配制，加 2.6 mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前配制，加 550 μL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。
粗酶液提取：
1、除去细胞核和线粒体等：称约 0.5g 组织，加入 4℃预冷的 1 mL 试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心 30min，取上清液，转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心 60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1 mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃上清液。
4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。
测定操作：
1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 550 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二在 37℃水浴中预热 30min。
3. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50μL 蒸馏水、900μL 试剂二、50μL 试剂三和 10μL 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10 s 和第 130 s 吸光值分别记为 A1 和 A2，△A 空白管=A2-A1。
4. 测定管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50μL 粗酶液、900μL 试剂二、50μL 试剂三和 10μL 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10 s 和第 130 s 吸光值分别记为 A3 和 A4，△A 测定管=A4-A3。

注意：空白管只需要做一次。
计算公式：
(1).按照蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活单位。
NCR 酶活性 (nmol/min/mg prot)= (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T= 529×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义：37℃中，每克样品每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活单位。
NCR 酶活性(nmol/min/g 鲜重)= (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷ T= 265×(△A 测定管-△A 空白管)÷W
ε：还原型细胞色素 C 摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，1010μL=0.00101L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积，50μL=0.05mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min。
注意事项：
试剂三、试剂四临用前配制，配好未使用完的 4℃可保存两天。

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。