滤纸酶测试盒/微量法说明书

测定意义：

纤维素酶是由微生物产生的多组分的酶系，能水解纤维素 β-1,4 葡萄糖苷键生成葡萄糖，研究滤纸酶活力对纤维素酶的研究具有非常重要的意义。

测定原理：

滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与 3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物，在 540nm 处有 光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比，可测定计算得滤纸酶的活力。
自备实验用品及仪器：
天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 40mL×1 瓶，4℃保存。
滤纸条：50mg×50 条。
酶液提取：
1. 组织：按照质量（g）：蒸馏水体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 蒸馏水）加入蒸馏水，冰浴匀浆后于 4℃，12000rpm 离心 10min，取上清置于冰上待测。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：蒸馏水体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 4℃，12000rpm离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体：直接检测。
测定操作：
1. 根据样本数量取两倍数量的滤纸条和 Ep 管，每支 Ep 管中放入一个卷状滤纸条（注意要放入底部），作为底物。
2. 对照管：取 200μL 灭活的酶液，加入 500μL 试剂一，充分混匀，再加入放有滤纸条的 Ep 管中，标注为对照管。
3. 测定管：取 200μL 酶液，加入 500μL 试剂一，充分混匀，再加入放有滤纸条的 Ep 管中，标注为测定管。
4. 对照管和测定管同时置于 50℃水浴锅中反应 30min。
5. 加入 800μL 试剂二，沸水浴 5min，自来水冷却后取 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中测定 540nm 处吸光值，分别记为 A 对照管和 A 测定管，△A= A 测定管- A 对照管。
酶活性计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.2805x - 0.0255，R2 = 0.9991

（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每毫克蛋白每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 0.891×（△A+0.0255）÷ Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每克组织每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T= 0.891×（△A+0.0255）÷ W
（3）按液体体积计算
酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每毫升培养液每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷V 样÷T= 0.891×（△A+0.0255）
（4）按细胞数量计算
酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每 104 个细胞每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷（V 样×细胞数量（万个）÷V 样总）÷T= 0.891×（△A+0.0255）÷ 细胞数量（万个）
V 反总：反应总体积，1.5mL，V 样：反应体系中加入样本体积，0.2mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；
Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.1403x - 0.0255，R2 = 0.9991
（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每毫克蛋白每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T=1.782×（△A+0.0255）÷ Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每克组织每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T= 1.782×（△A+0.0255）÷ W
（3）按液体体积计算
酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每毫升培养液每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反总÷V 样÷T= 1.782×（△A+0.0255）
（4）按细胞数量计算
酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每 104个细胞每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反总÷（V 样×细胞数量（万个）÷V 样总）÷T= 1.782×（△A+0.0255）÷ 细胞数量（万个）
V 反总：反应总体积，1.5mL，V 样：反应体系中加入样本体积，0.2mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；
Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
注意事项
1. 用干净的镊子取出滤纸条，带手套卷成卷放入 Ep 管底部。
2. 样本灭活时保证同一批样本处理时间一致，建议沸水浴十分钟。
3. 批量样本测定之前先做 1-2 个样本的预实验，若吸光值超过 1.2，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。
4. 显色后取检测液时注意枪头不要碰到滤纸条，以免带入毛状物，影响测定结果。

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。