酸性木聚糖酶(ACX)测试盒/微量法说明书

测定意义：

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生，能催化水解木聚糖，也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶，可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及 β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而广泛的应用于酿造和饲料工业中，ACX 一般分离自耐酸的真菌，细菌及部分霉菌。

测定原理：

ACX 在酸性环境下能将木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，进一步在沸水浴条件下与 3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在 540nm 处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在 540nm 吸光值增加速率，可计算 ACX 活力。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、恒温水浴锅，可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制：
缓冲液：液体 90mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。（若出现白色絮状或颗粒状沉淀，可 60℃加热溶解后使用）。
试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。
粗酶提取：
1. 发酵液：发酵液于 8000g，4℃，离心 15min，取上清，作为待测样品。
2. 酶干粉：称约 0.1mg，加 1mL 缓冲液溶解待测。
3. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL缓冲液）进行冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清待测。
测定操作表：
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 540nm。
2、操作表

ACX 计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 2.5554x - 0.002 ，R2 = 0.9983
1. 按液体体积活力计算：
酶活定义：50℃，pH4.8 条件下，每毫升液体样本每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力（nmol/min/mL）= （ΔA+0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×106= 435× (ΔA+0.002)
2. 按蛋白浓度计算：
酶活定义：50℃，pH4.8 条件下，每毫克蛋白每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA +0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×106÷Cpr= 435×(ΔA +0.002 ) ÷Cpr
3. 按鲜重计算：
酶活定义：50℃，pH4.8 条件下，每克样本每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力（nmol/min/g 鲜重）= （ΔA +0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×106÷W= 435×(ΔA +0.002 ) ÷W
150：木糖的分子量；T：反应时间，30min；稀释倍数=V 反总÷V 样=300μL÷60μL=5；
106：转化因子，即 1mg/mL=106ng/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 1.2777x - 0.002 ，R2 = 0.9983
1. 按液体体积活力计算：
酶活定义：50℃，pH4.8 条件下，每毫升液体样本每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力（nmol/min/mL）= （ΔA+0.002）÷1.2777÷150÷T×稀释倍数×106= 869.6× (ΔA+0.002)
2. 按蛋白浓度计算：
酶活定义：50℃，pH4.8 条件下，每毫克蛋白每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA +0.002）÷1.2777÷150÷T×稀释倍数×106÷Cpr= 869.6×(ΔA +0.002 ) ÷Cpr
3. 按鲜重计算：
酶活定义：50℃，pH4.8 条件下，每克样本每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力（nmol/min/g 鲜重）= （ΔA +0.002）÷1.2777÷150÷T×稀释倍数×106÷W= 869.6×(ΔA +0.002 ) ÷W
150：木糖的分子量；T：反应时间，30min；稀释倍数=V 反总÷V 样=300μL÷60μL=5；
106：转化因子，即 1mg/mL=106ng/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
注意事项：
1. 吸光度变化应该控制在 0.01～0.8 之间，否则加大样品量或稀释样品，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。
2. 试剂盒 2-8℃保存，保质期 3 个月，建议尽快使用。

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。