α-半乳糖苷酶(α-GAL)测试盒/微量法说明书

测定意义：

α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化 α 半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL 对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的 D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。

测定原理：

α-GAL 分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有 吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算 α-GAL 活性。
自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 2.5mL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二：液体 4mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 13mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列试剂）：

α-GAL 活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为 y = 0.00585x -0.0027；x 为标准品浓度（nmol/mL），y 为吸光值。
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
α-GAL 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
α-GAL 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.08×(ΔA +0.0027)
V 反总：反应体系总体积，0.07mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，30min。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0039x -0.0027；x 为标准品浓度（nmol/mL），y 为吸光值。
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
α-GAL 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
α-GAL 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.12×(ΔA +0.0027)
V 反总：反应体系总体积，0.07mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，30min。

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