纤维素酶(CL)/羧甲基纤维素酶测试盒/微量法说明书

测定意义：

CL（EC 3.2.1.4）存在于细菌、真菌和动物体内，能够催化羧甲基纤维素降解，是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。

测定原理：

采用蒽酮比色法测定CL催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。
 
需自备的仪器和用品： 
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、浓硫酸和蒸馏水。
 
试剂的组成和配制： 
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 6mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 40mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存； 临用前加入 5mL 蒸馏水和 45mL 浓硫酸充分溶解待用。
 
样品测定的准备： 
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
加样表和测定步骤： 

37℃振荡反应 1h 后，90℃水浴 15min（盖紧，防止水分散失），冷却后8000g 25℃离心 10min，取上清，得糖化液

混匀， 90℃水浴 10min（盖紧，防止水分散失），冷却，取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，测 620nm 下吸光值 A，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管设一个对照管。
CL 活力计算： 
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定的回归方程为 y = 5.018x - 0.0462；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。
2、血清（浆）CL 活力的计算
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。CL 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反总]÷V 样÷T =39.8×(ΔA+0.0462)
3、细胞、细菌和组织中 CL 活力的计算
（1）按照蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反总]÷(V 样×Cpr) ÷T=39.8×(ΔA+0.0462) ÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg /min /g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=39.8×(ΔA+0.0462) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.0796×(ΔA+0.0462)
1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反总：反应体系总体积，0.6mL； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、标准条件测定回归方程为 y = 2.5090x - 0.0462；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。
2、血清（浆）CL 活力的计算
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷2.509×V 反总]÷V 样÷T =79.6×(ΔA+0.0462)
3、细胞、细菌和组织中 CL 活力的计算
（1）按照蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg /min /mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462)÷2.509×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=79.6×(ΔA+0.0462) ÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg /min /g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.0462)÷2.509×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=79.6×(ΔA+0.0462)÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL 活力(μg /min /104cell)=[1000×(ΔA+0.0462)÷2.509×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.1592×(ΔA+0.0462)
1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反总：反应体系总体积，0.6mL； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：
加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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