山梨醇脱氢酶(SH)测试盒/微量法说明书

测定意义：

SH（EC 1.1.1.14）催化山梨醇脱氢生成果糖，是调控生物体内山梨醇含量的关健酶之一。

测定原理：

SH 催化山梨醇脱氢生成果糖，同时还原 NAD+生成 NADH，测定 340nm 吸光度增加速率可以计算 SH 活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
 
试剂组成和配制： 
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；
 
粗酶液提取： 
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
 
测定步骤： 
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）在试剂二中加入 7.6mL 试剂一和 11.4mL 蒸馏水充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；用不完的试剂 4℃保存一周；
（2）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂二，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
SH 活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）SH 活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

SH（nmol/min/mL）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=1608×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 SDH 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
SH（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
SH（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1608×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
SH（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=3.216×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）SH 活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
SH（nmol/min /mL）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=3216×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 SH 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
SH（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
SH（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=3216×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
SH（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=6.426×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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