蔗糖合成酶(分解方向 SS-Ⅰ)测试盒/微量法说明书

测定意义：

蔗糖是源（叶片等）光合产物向“库”器官运输的主要形态。蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是双向反应酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代谢的关键酶之一。研究其分解方向 SS-Ⅰ的活性对于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意义。

测定原理：

SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游离果糖和UDPG，采用3,5－二硝基水杨酸法测定还原糖的含量来反映酶活性的高低。
 
需自备的仪器和用品： 
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰
 
试剂的组成和配制： 
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二： 液体 5mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×2 支，-20℃保存；临用前每支加入 1.2mL 试剂二充分溶解待用，现配现用；
试剂四：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。
样品测定的准备：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
 
测定步骤： 
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定，（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

混匀，取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，540nm 下测定各管吸光值。ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需要设一个对照管。
SS-Ⅰ活性计算： 
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.0012x - 0.0492；x 为标准品浓度（μg/mL），y 为ΔA。
2、按照蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0012×V 反总]÷(V 样×Cpr) ÷T=138.9×(ΔA+0.0492) ÷Cpr
3、按照样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/g 鲜重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0012×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=138.9×(ΔA+0.0492) ÷W
V 反总：反应体系总体积，0.05mL； V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；
T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.0006x - 0.0492；x 为标准品浓度（μg/mL），y 为ΔA。
2、按照蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0006×V 反总]÷(V 样×Cpr) ÷T=277.8×(ΔA+0.0492) ÷Cpr
3、按照样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/g 鲜重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0006×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=277.8×(ΔA+0.0492) ÷W
V 反总：反应体系总体积，0.05mL； V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；
T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

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