细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)测试盒/微量法说明书

测定意义：

蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH，Ivr 分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两种类型。 AI 的最适 pH 为 3～5。AI 分为可溶性 AI(S-AI)和细胞壁不溶性 AI（B-AI）两种类型。B-AI 存在于细
胞间隙并结合在细胞壁上，主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解，以维持库源之间蔗糖的浓度。

测定原理：

B-AI 催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与 3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在 510nm有特征光吸收，在一定范围内 510nm 光吸收增加速率与 B-AI 活性成正比。
 
自备用品： 
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
 
试剂组成和配制： 
提取液 1：液体 100mL×1 瓶，4℃保存;
提取液 2：液体 100mL×1 瓶，4℃保存;
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存;
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 10mL 试剂一充分溶解备用；用不完的试剂 4℃保存;
试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃保存；
 
粗酶液提取： 
按照组织质量（g）：提取液 1 体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液 1），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min，弃上清，沉淀中加入 1mL 蒸馏水，充分震荡混匀，12000g 4℃离心 10min，弃上清，沉淀中加入 1mL 提取液 2 充分混匀，4℃浸提过夜，12000g 4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
 
测定步骤和加样表： 
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 510nm，蒸馏水调零。
2、样本测定，（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

混匀，95℃水浴 10min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀，取 200μL 至微量石英比色皿或 96孔板中， 510nm 处记录各管吸光值 A，如果吸光值大于 2，可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数)，ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管设一个对照管。
B-AI 活性计算： 
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 
标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0016x -0.001；x 为标准品浓度（μg/mL），y 为吸光值。
（1）按蛋白浓度计算：
单位的定义：37℃每 mg 蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
B-AI 活性（μg /min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr
（2）按鲜重计算：
单位的定义：37℃每 g 组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
B-AI 活性（μg /min /g 鲜重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W
V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0008x -0.001；x 为标准品浓度（μg/mL），y 为吸光值。
（1）按蛋白浓度计算：
单位的定义：37℃每 mg 蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
B-AI 活性（μg /min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr
（2）按鲜重计算：
单位的定义：37℃每 g 组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
B-AI 活性（μg /min /g 鲜重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W
V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。

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