可溶性淀粉合成酶(SSS)测试盒/微量法说明书

测定意义：

SSS（EC 2.4.1.21）通常以游离态存在于质体基质中，催化淀粉链延长，主要负责支链淀粉的合成。

测定原理：

SSS 催化 ADPG 与淀粉引物(葡聚糖)反应，将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成 ADP，在反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还原为 NADPH，NADPH 生成量与前一步反应中 ADP 生成量呈正比，340nm 下测定 NADPH 增加量即可计算 SSS 活性。
需自备的的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：40mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 14mL 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 8mL 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 10mL 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂五：液体×1 支，-20℃保存；临用前加入 500μL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 500μL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
粗酶液制备：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、在 EP 管中按顺序加入下列试剂

SSS 活性计算：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
1、按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SSS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T×稀释倍数=529×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
SSS 活性（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样÷V 样总×W）÷T×稀释倍数=529×ΔA÷W
V 反总：反应体系总体积，2.6×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.075 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.9；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：
1、按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
SSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T×稀释倍数=1059×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按照样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
SSS 活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样÷V 样总×W）÷T×稀释倍数 =1059×ΔA÷W
V 反总：反应体系总体积，2.6×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.075 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.9；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。

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