磷脂酶C(PLC)测试盒/微量法说明书

测定意义：
磷脂酶 C（EC3.1.4.3）是一种水解甘油磷酸酯 C3 位点甘油磷酸酯键的脂类水解酶，广泛存在于微生物及动植物的组织和细胞中，在细 胞 代 谢、细胞传递、生 长 发 育等方面具有重要作用。

测定原理：

磷脂酶 C 催化水解 NPPC 产生对硝基苯酚，在 410nm 处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器：
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 102mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体 8mL×1 瓶，4℃保存。
酶液提取：
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后于 4℃，10000g离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。
3. 血清：直接测定。

测定操作：

酶活计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0191x - 0.0103，R2 = 0.9991
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC 活性（nmol/min/mg prot）=（A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T = 17.45×（A+0.0103）÷ Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC 活性（nmol/min/g 鲜重）=（A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T = 17.45×（A+0.0103）÷ W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每 104个细胞每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC 活性（nmol/min/104 cell）=（A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量) ÷T = 17.45×（A+0.0103）÷ 细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC 活性（nmol/min/mL）= （A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷V 样÷T= 17.45×（A+0.0103）
V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0095x - 0.0103，R2 = 0.9991
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC 活性（nmol/min/mg prot）=（A+0.0103）÷ 0.0095×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T = 35.09×（A+0.0103）÷ Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC 活性（nmol/min/g 鲜重）=（A+0.0103）÷ 0.0095×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T = 35.09×（A+0.0103）÷ W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每 104个细胞每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC 活性（nmol/min/104 cell）=（A+0.0103）÷ 0.0095×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量) ÷T =35.09×（A+0.0103）÷ 细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC 活性（nmol/min/mL）= （A+0.0103）÷ 0.0095×V 反总÷V 样÷T = 35.09×（A+0.0103）
V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min

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