游离胆固醇(FC)含量测试盒/分光光度法说明书

测定意义：
FC 是构成细胞膜的主要成分，也是合成肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素 D 等生理活性物质的重要原料。FC 浓度可作为脂代谢的指标。

测定原理：

FC 氧化酶催化 FC 生成△4-胆甾烯酮和 H2O2，过氧化物酶催化 H2O2、4-氨基安替比林和酚生成红色醌类化合物，在 500nm 有吸收峰，其颜色深浅与 FC 含量成正比。
自备仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿、异丙醇和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：异丙醇 50mL（自备）；
试剂二：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；
试剂四：液体 100μL×1 瓶，4℃保存；
标准品：液体 1mL×1 支，浓度为 0.5 μ mol/mL，4℃保存。
FC 的提取：
1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：先收集 400-500 万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加 1mL 试剂一，超声波破碎 1min（强度 20％，超声 2s，停 1s），即 FC 待测液。
3．血清（浆）样品：直接测定。
测定操作：
1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 500 nm，蒸馏水调零。
2.FC 工作液的配制：临用前，吸取约 0.8mL 试剂二分别加入试剂三和试剂四瓶中，充分溶解后再全部转移回试剂二瓶中，充分混匀，FC 工作液置于 37℃水浴 10min。用不完的工作液 4℃保存一周。
3. 标准管：依次在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL FC 标准液和 900μL FC 工作液，混匀，37℃静置 3h 后于500nm 测定 A 标准管。
4. 测定管：依次在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL FC 待测液和 900μL FC 工作液，混匀，37℃静置 3h 后于500nm 测定 A 测定管。
5、空白管：依次在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 试剂一和 900μL FC 工作液，混匀，37℃静置 3h 后于500nm 测定 A 测定管。

注意：
1、 标准管和空白管只需测定一次。
2、若测定管产生白色浑浊，可以将待测液用异丙醇稀释 2~5 倍后测定，并在 结果乘以相应倍数。
计算公式：
1. 血清（浆）中 FC 含量计算：
FC 含量（μmol /dL）= C 标准液×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）×100mL=50×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）C 标准液：0.5μmol/mL；100 mL：1dL=100 mL。
2. 组织中 FC 含量计算：
(1)按样本蛋白浓度计算
FC 含量（μmol / mg prot）= C 标准液×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr = 0.5×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
FC 含量（μmol / g 鲜重）= C 标准液×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷W= 0.5×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷W
C 标准液：0.5μmol/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL
3. 细胞、细菌中 FC 含量计算：
FC 含量（μmol /104 cell）= C 标准液×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷细菌或细胞（104 cell/L）=0.5×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷细菌或细胞（104 cell /L）C 标准液：0.5μmol/mL。 检出限为 1nmol/mL。

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