酰基转移酶(AAT)测试盒/微量法说明书

测定意义：
AAT 是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

测定原理：

AAT 催化乙酰 CoA 转移乙酰基到丁醇，释放的 CoA 还原 DTNB 生成 TNB；TNB 在 412nm 有吸收峰，测定 412 nm 吸光度增加速率可计算 AAT 活性。
自备仪器和用品：
研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存。
试剂三：粉剂×1 支，4℃避光保存。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 液体：直接检测。
AAT 测定操作：
1、分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。
2、工作液的配制：临用前在试剂二瓶中加入 18mL 试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、试剂三的配制：临用前加无水乙醇 1mL 充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存。
4、 空白管：在 Ep 管或 96 孔板中加入 10μL 提取液和 180μL 工作液，充分混匀，35℃反应 15min，加入 10μL试剂三，充分混匀，25℃静置 10min，测定 412nm 处吸光值，记为 A 空白管。
5、 测定管：在 Ep 管或 96 孔板中加入 10μL 样本和 180μL 工作液，充分混匀，35℃反应 15min，加入 10μL试剂三，充分混匀，25℃静置 10min，测定 412nm 处吸光值，记为 A 测定管。△A=A 测定管- A 空白管，空白管只要做一管。
AAT 活性计算：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（? ×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T = 98.04×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min /g 鲜重) = △A ÷（? ×d）×V 反总÷(W×V 样÷V 样总) ÷T = 98.04×△A÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（? ×d）×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T= 98.04×△A÷ 细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：每毫升样品每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（? ×d）×V 反总÷V 样÷T = 98.04×△A ：TNB 消光系数，13600L/mol/cm；d：比色皿光径：1cm；V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，15 min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（? ×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T =196.08×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min /g 鲜重) = △A ÷（? ×d）×V 反总÷(W×V 样÷V 样总) ÷T = 196.08×△A÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（? ×d）×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T=196.08×△A÷ 细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：每毫升样品每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（? ×d）×V 反总÷V 样÷T = 196.08×△A ：TNB 消光系数，13600L/mol/cm；d：96 孔板光径：0.5cm；V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，15min。

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