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碱性蛋白酶(AKP)测试盒/分光光度法
物品单位 价格 品牌
453 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:50管/24样
  • 发布日期: 2022-11-15
  • 更新日期: 2022-11-17
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876610S
用途范围 碱性条件下,碱性蛋白酶可将酪蛋白水解产生酪氨酸;酪氨酸进一步还原磷钼酸生成钨蓝;在680nm有特征吸收峰。
纯度 99%
CAS编号
规格 50管/24样
是否进口

碱性蛋白酶(AKP)测试盒/分光光度法说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:
AKP 是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类,属于丝氨酸蛋白酶。此外,该酶还能够水解酯键、酰胺键,具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一,广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。


测定原理:

在碱性条件下,AKP 水解酪蛋白生成酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝;钨蓝在 680nm有特征吸收峰,测定 680nm 吸光度增加速率,来计算 AKP 活性。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mL EP 管、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体 90mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加 10 mL 蒸馏水溶解。
试剂三:粉剂×1 瓶,4℃避光保存。临用前加入 20 mL 试剂一,沸水浴中磁力搅拌溶解。(可在烧杯上盖一层保鲜膜,注意观察,避免水分全部蒸发,一般加热 15-30 分钟,该试剂为过饱和试剂,充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用)。
试剂四:粉剂×1 瓶, 4℃保存。临用前加 50 mL 蒸馏水溶解。
试剂五:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。
标准品:液体 1mL×1 支,0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液,4℃保存。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心 10min,取上清,即粗酶液。
2. 血清或培养液:直接测定。
3. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
测定操作:
1. 分光光度计预热 30min,调节波长到 680 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二、试剂三和试剂四置于 40℃水浴保温 30min。
3. 对照管:取一支 EP 管,加入 100μL 粗酶液(血清或培养液),200μL 试剂二,混匀后置于 40℃水浴保温 10min;加入 200μL 试剂三,混匀后 8000g ,4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入新的 EP 管,再加入 1000μL 试剂四,200μL 试剂五,混匀后置于 40℃水浴保温 20min,于 680nm 测定光吸收,记为 A 对照管。
4. 测定管:取一支 EP 管,加入 100μL 粗酶液(血清或培养液),200μL 试剂三,混匀后置于 40℃水浴保温 10min;加入 200μL 试剂二,混匀后 8000g ,4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入新的 EP 管,再加入 1000μL 试剂四,200μL 试剂五,混匀后置于 40℃水浴保温 20min,于 680nm 测定光吸收,记为 A 测定管。(注意与对照管不同,先加试剂三,后加试剂二)
5. 空白管:取一支 EP 管,加入 200μL 蒸馏水,1000μL 试剂四 200μL 试剂五,混匀后置于 40℃水浴保温20min,于 680nm 测定光吸收,记为 A 空白管。
6.标准管:取 EP 管,加入 200μL 标准品,1000μL 试剂四,200μL 试剂五,混匀后置于 40℃水浴保温20min,于 680nm 测定光吸收,记为 A 标准管。
注意:空白管和标准管只需要测定一次。
计算公式:
1. 按照样本蛋白浓度计算
AKP 活性单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
AKP 活性(nmol/min /mg prot)= C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr
2.按照样本质量计算
AKP 活性单位定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
AKP 活性(nmol/min /g 鲜重)=C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总÷(W×V1÷V2)÷T= 125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W
3. 按照液体体积计算
AKP 活性单位定义:30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
AKP 活性(nmol/min/mL)=C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总÷V1÷T=125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)
4. 按照细胞数量计算
AKP 活性单位定义:30℃每 104个细胞每分钟催化水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
AKP 活性(nmol/min /104 cell)=C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总÷(细胞数量×V1÷V2)÷T= 125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷细胞数量
C 标准品:0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液;V 反总:酶促反应总体积,0.5mL;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),0.1 mL;V2:提取液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min;W:样品质量(g)。
注意事项:
临用前配制的试剂配置好后 3 天内使用完毕。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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