己糖激酶(HK)测试盒/分光光度法说明书

测定意义：
HK（EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的 个关键酶，催化葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

测定原理：

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成 NADPH，NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 30mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 30mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：液体 5 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 4mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 2mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 250μL 试剂一和 250μL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂一、二、三、四和五 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟。
3、 加样表：

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，在 340 nm 波长下记录 20秒时的初始吸光度 A1 和 5 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。
注意事项：
1、为了减小操作误差，建议将试剂一、二、三、四、五按比例配成混合液，预热 10min，取 30μL 样本+8μL试剂六+1mL 混合液，混匀后按照上述步骤检测。
2、不同匀浆组织中 HK 活力不一样，做正式试验之前请做 1-2 只预试，若 ΔA>0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至 2min,使ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。

HK 活性计算：
1、血清（浆）HK 活性
单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=1113×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 HK 活性
（1）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=1113×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=2.226×ΔA
V 反总：反应体系总体积，1.038×10-3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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