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己糖激酶(HK)测试盒/微量法
物品单位 价格 品牌
947 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:100管/96样
  • 货号:LM-876603S
  • 发布日期: 2022-11-15
  • 更新日期: 2022-11-15
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876603S
用途范围 HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH,NADPH在340nm有特征吸收峰。
纯度 99%
CAS编号
规格 100管/96样
是否进口

己糖激酶(HK)测试盒/微量法说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:
HK(EC 2.7.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是葡萄糖分解过程中的 个关键酶,催化葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。


测定原理:

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成 NADPH,NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 20mL×1 瓶, 4℃保存;
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存;
样本的前处理:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)在试剂二中加入 18mL 试剂一充分溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
(2)在试剂三中加入 1mL 试剂一,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
(3)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三和 180μL 试剂二,混匀,立即记录340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。
注意:不同匀浆组织中 HK 活力不一样,做正式试验之前请做 1-2 只预试,若 ΔA>0.5,则说明组织活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至 2min,使 ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。
HK 活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)HK 活性
单位的定义:每毫升血清(浆)在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=643×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 HK 活性
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)HK 活性
单位的定义:每毫升血清(浆)在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=1286×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 HK 活性
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.572×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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