羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGCS)测试盒/微量法说明书

测定意义：
羟甲基戊二酰辅酶 A 合成酶是甲羟戊酸代谢途径中的关键酶，催化乙酰 CoA 与乙酰乙酰 CoA 生成羟甲基戊二酰 CoA。

测定原理：

HMGCS 催化乙酰 CoA 与乙酰乙酰 CoA 生成羟甲基戊二酰 CoA，同时产生 CoASH，使 DTNB 转化为黄色的TNB，在 412nm 下有特征吸光值。

所需的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存；临用前加入 3mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存；临用前加入 3mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：6mL×1 瓶，4℃避光保存。

样本测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。
2、 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 25μL 试剂一、25μL 试剂二和 50μL 试剂三，混匀，加入 100μL 样本上清，迅速混匀后记录 412nm 下初始吸光值 A1 和 4min 后的吸光值 A2。计算 ΔA＝A2-A1。
HMGCS 活性计算：
用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）活性
单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1nmolTNB 为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样 ÷T=36.76×ΔA
2、组织、细菌或细胞 HMGCS 活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmolTNB 为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=36.76×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmolTNB 为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V 样÷V 样总）÷T=36.76×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmolTNB 为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /104 cel）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.074×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，4 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）活性
单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1nmolTNB 为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样 ÷T=73.53×ΔA
2、组织、细菌或细胞 HMGCS 活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmolTNB 为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=73.53×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmolTNB 为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V 样÷V 样总）÷T=73.53×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmolTNB 为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /104 cel）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.147×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，4 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

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