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甲基柠檬酸合酶(MCS)测试盒/微量法
物品单位 价格 品牌
4650 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:100管/96样
  • 货号:LM-876548S
  • 发布日期: 2022-11-14
  • 更新日期: 2022-11-14
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876548S
用途范围 MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶A,进一步水解产生甲基柠檬酸;该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB,在 412nm处有特征吸光值。
纯度 99%
CAS编号
规格 100管/96样
是否进口

甲基柠檬酸合酶(MCS)测试盒/微量法说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:
MCS 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,与柠檬酸合酶(CS)共同参与三羧酸循环的调节。


测定原理:

MCS 催化丙酰 CoA 和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶 A,进一步水解产生甲基柠檬酸;该反应促使无色的DTNB 转变成黄色的 TNB,在 412nm 处有特征吸光值。
 
需自备的仪器和用品: 
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
 
试剂组成和配制: 
试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:液体 20mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:液体 1.5mL×1 支,-20℃保存;
试剂四:液体 30mL×1 瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存,临用前加入 1mL 蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存;
 
样本的前处理: 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g,4℃离心 5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
④ 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 CS(此步可选做)。
⑤ 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体 CS 测定。
测定步骤: 
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)在试剂五中加入 1mL 无水乙醇和 22mL 试剂四,混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(2)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、220μL 试剂五和 10μL 试剂六,混匀,记录 412nm处 20 秒时的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒时的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-A1。
MCS 活性计算:
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
MCS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
MCS(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=177.8×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
MCS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.3556×ΔA V 反总:反应体系总体积,2.4×10-4 L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
MCS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
MCS(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=355.6×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
MCS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.711×ΔA V 反总:反应体系总体积,2.4×10-4 L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
配方:
试剂一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;(50mM Tris-HCl 7.4,8.56g 蔗糖,88mg EDTA)
试剂二:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;(10mM Tris-HCl 7.4,1%Trixton-100)
试剂三:液体 1.5mL×1 支,4℃保存;(100mM PMSF)
试剂四:液体×1 瓶,4℃保存;(称 0.135g Tris,0.166g KCl,8.4mgEDTA,溶于 27.5mL 双蒸水,用 HCl 调 pH至 7.5)
试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存;(称取 2mg DTNB,2mg 丙二酰 CoA 于 30mL 试剂瓶)
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;(称取 0.6mg 草酰乙酸于 1.5mLEP 管)

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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