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线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)测试盒/微量法
物品单位 价格 品牌
567 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:100管/96样
  • 货号:LM-876560S
  • 发布日期: 2022-11-14
  • 更新日期: 2022-11-14
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876560S
用途范围 MDHm催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。
纯度 99%
CAS编号
规格 100管/96样
是否进口

线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)测试盒/微量法说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:
MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中 MDH 是 TCA 循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH 分为NAD-依赖的 MDH 和 NADP-依赖的 MDH,细菌中通常只含有 NAD-MDH,在真核细胞中,NAD-MDH 分布于细胞质和线粒体中。


测定原理:

MDHm 催化 NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致 340nm 处光吸收下降。
 
需自备的仪器和用品: 
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。
 
试剂的组成和配制: 
试剂一:100mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:20mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:1.5mL×1 支,-20℃保存;
试剂四、液体 20 mL×1 瓶,在 4℃保存;
试剂五、粉剂×1 瓶,-20℃保存;
 
样本测定的准备: 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆液于 600g,4℃离心 5min。
3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
4、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 MDH(此步可选做)。
5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于 MDHm 活性测定。
 
测定步骤: 
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、检测工作液的配制:用时在试剂五中加入 19mL 试剂四和 0.5mL 蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
3、测定前将检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 样本和 195μL 工作液,混匀后立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。
MDHm 活力单位的计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
MDHm(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
MDHm(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T =1299×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
MDHm(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V 样÷V 样总)÷T=0.65×ΔA V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.005 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;2000:细胞或细菌总数,2000 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
MDHm(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
MDHm(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T =2598×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
MDHm(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V 样÷V 样总)÷T=1.3×ΔA V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.005 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;2000:细胞或细菌总数,2000 万。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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