线粒体柠檬酸(MCA)含量测试盒/微量法说明书

测定意义：
MCA 是线粒体三羧酸循环的 个中间产物，由柠檬酸合酶催化乙酰 CoA 与草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循环强度的主要指标之一。
配合测定丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性、乙酰 CoA 含量、柠檬酸合酶活性和 MCA 含量，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脱氢酶活性变化可以反映糖酵解进行程度，（2）综合分析丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性和乙酰 CoA 含量变化可以反映脂肪酸β-氧化途径提供的乙酰 CoA 情况，（3）乙酰 CoA 含量、柠檬酸合酶活性和 MCA 含量变化可以反映三羧酸循环进行状况。

测定原理：

MCA 在柠檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性条件下，α-酮酸进一步与苯肼反应，生成相应的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在 330nm 处有吸收峰，该波长下吸光度的变化程度可反映出 MCA的含量。

自备仪器和用品：
分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研钵、蒸馏水。

试剂组成和配制：
酸性提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
碱性提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 2mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 6mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保存；
标准液：液体 1mL×1 支，10μmol/mL 柠檬酸标准液，4℃保存。
线粒体中柠檬酸提取：
称 0.05~0.1g 样品（建议称 0.1g 样本），加入 0.5mL 酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃离心 5min；取上清至另一 EP 管中，11000g/min 4℃离心 10min，弃上清（取 300μL 该上清液和 300μL 碱性提取液中和后可用于细胞质 CA 含量测定）；沉淀即线粒体，向沉淀中加入 0.5mL 酸性提取液，充分悬浮溶解，超声波破碎（功率 20％，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），取此溶液 300μL 和 300μL 碱性提取液中和，混匀，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 330nm，蒸馏水调零。
2、试剂一、二和三 37℃预热 10min。
3、样本测定：
空白管和标准管只需要各做一个。

柠檬酸含量计算：
（1）按蛋白浓度计算
柠檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 标准管×(ΔA 测定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 标准管－ΔA 空白管) ×V 样]÷（V 样÷Cpr）=10×(ΔA 测定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 标准管－ΔA 空白管)÷Cpr
蛋白质含量需要另外测定。
（2）按样本鲜重计算
柠檬酸含量(μ mol/g 鲜重)=[C 标准管×(ΔA 测定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 标准管－ΔA 空白管) ×V 样]÷（W×V样÷V 样总）=10×(ΔA 测定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 标准管－ΔA 空白管)÷W C 标准管：标准液浓度，10μmol/mL； V 样：加入反应体系中样本体积：0.06mL；V 样总：加入提取液体积：1mL；Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
注意： 检测限为 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鲜重。

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。