线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)测试盒/分光光度法说明书

测定意义：
ICDHm（EC 1.1.1.41）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，在三羧酸循中催化异柠檬酸生成 α-酮戊二酸，同时将 NAD+ 还原为 NADH，是三羧酸循环的限速酶之一，其催化的反应是细胞 NADH主要来源之一。

测定原理：

ICDHm 催化 NAD+ 还原生成 NADH，导致 340nm 处光吸收上升。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：50mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：10mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：1mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 支，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；
试剂七：粉剂×1 支，-20℃保存; 临用前加入 3mL 蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六转移到试剂四中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 ICDHm（此步可选做）。
5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 ICDHm 活性测定。
测定步骤：
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm 处，蒸馏水调零。
2、 工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。
3、 在 1mL 石英比色皿中依次加入 60μL 试剂七、80μL 样本和 1mL 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s时的吸光值 A1 和 2min20s 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
ICDHm 活性计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。
ICDHm 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T=1145×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。
ICDHm（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=231.3×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。
ICDHm 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.463×ΔA V 反总：反应体系总体积，1.14×10-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.08 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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