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α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)测试盒/分光光度法
物品单位 价格 品牌
648 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:50管/48样
  • 货号:LM-876577S
  • 发布日期: 2022-11-14
  • 更新日期: 2022-11-14
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876577S
用途范围 α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、 二氧化碳和 NADH,NADH在340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
纯度 99%
CAS编号
规格 50管/48样
是否进口

α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)测试盒/分光光度法说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:
α-KGDH(EC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中,是三羧酸循环调控关键酶之一,催化 α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶 A。


测定原理:

α-KGDH 催化 α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶 A 生成琥珀酰辅酶 A、 二氧化碳和 NADH,NADH 在 340 nm有特征吸收峰,以 NADH 的生成速率表示 α-KGDH 活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:50mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:10mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:1mL×1 支,-20℃保存;
试剂四:液体 55.5mL×1 瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1 支,4℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,4℃保存;
试剂七:粉剂×1 支,4℃保存;
试剂八:粉剂×1 支,4℃保存;
试剂九:粉剂×1 支,-20℃保存;
试剂十:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入 2.1mL 蒸馏水充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
工作液的配制:临用前把试剂五、试剂六、试剂七、试剂八和试剂九转移到试剂四中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆 600g,4℃离心 5min。
3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
4、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 α-KGDH(此步可选做)。
5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体 α-KGDH 活性测定。

测定步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm 处,蒸馏水调零。
2、工作液于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min。
3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 40μL 试剂十、60μL 样本和 1.1mL 工作液,混匀,立即记录 340nm 处 20s的吸光值 A1 和 2min20s 时的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。
α-KGDH 活性计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
α-KGDH 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
α-KGDH(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=325×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
α-KGDH 活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.65×ΔA
V 反总:反应体系总体积,1.2×10-3 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.06 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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