亮氨酸氨基肽酶（Leucine Aminopeptidase, LAP）
试剂盒说明书

测定意义：
LAP 是一类能水解肽链 N-末端为亮氨酸的酶，广泛存在于肝、肾、胰等组织中，尤其以肝脏中含量最为丰富。各类肝 病 患者因肝细胞损伤，血清 LAP 的活性均有不同程度的升高，因此，血清 LAP 活性的检测能从不同侧面反映各种肝 病的发生和发展。

测定原理：

LAP 分解 L-亮氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在 405nm 有 吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算 LAP 活性。

自备用品：
酶标仪/可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96 孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

样本的前处理：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 1000~5000：1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。

LAP 测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂二转移至试剂一中充分溶解（如较难溶解，可 50℃水浴加热约 30min 促进溶解）；在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 50μL 样本和 150μL 试剂一，混匀后立即记录 405nm 处初始吸光值A1 和 2min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

注意事项：若 ΔA 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。使 A2-A1 小于 0.5，可提高检测灵敏度。
LAP 活力单位的计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）LAP 活力的计算:
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟生成 1 nmol 的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=205.8×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 LAP 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=205.8×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V 样÷V 样总) ÷T=0.103×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）LAP 活力的计算:
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟生成 1 nmol 的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=411.5×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 LAP 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷ (V 样×Cpr) ÷T=411.5×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=411.5×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V 样÷V 样总) ÷T=0.206×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000 万。