谷氨酸脱羧酶（(Glutamate decarboxylase，GAD）试剂盒

测定意义：
谷氨酸脱羧酶是将谷氨酸转化成抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的限速酶，γ-氨基丁酸是中枢神 经 系 统中有效的抑制性神经递质，具有降 血 压、增进脑活力、营养神经细胞、保持神经安定、促 进 生 长 激 素 分 泌和保 肝利肾等作用，目前在医药和保健食品中已有广泛的应用。

测定原理：

GAD 催化谷氨酸产生 GABA，利用 berthelot 反应测定 GABA 含量，从而测定 GAD 活性。
需自备的仪器和用品：
酶标仪、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 12mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 12mL×1 瓶，4℃避光保存；
试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；
试剂四：液体 6mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：液体 12mL×1 瓶，4℃避光保存；
试剂六：液体 12mL×1 瓶，4℃保存；

试剂七：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。
样品测定的准备：
1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复 30 次）；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织的处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液），冰浴中匀浆。8000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、在 EP 管中加入如下试剂

2、在新 EP 管中加入如下试剂

混匀，取 200μL 于 96 孔板，测定 640nm 下吸光值 A 测定与 A 对照，ΔA=A 测定-A 对照，每个测定管设一个对照管。
GAD 活力计算：
1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.0682x - 0.0432，R2 = 0.999；x 为标准品浓度（μmol/mL），y 为吸光值。
2、按照蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μmol GABA 定义为一个酶活力单位。 GAD 活力(μmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0432) ÷0.0682×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T=0.733×(ΔA+0.0432) ÷Cpr
3、按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μmol GABA 定义为一个酶活力单位。 GAD 活力(μmol/min/g鲜重)=(ΔA+0.0432) ÷0.0682×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=0.733×(ΔA+0.0432) ÷W
4、按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μmol GABA 定义为一个酶活力单位。 GAD 活力mol/min/104 cell)=(ΔA+0.0432) ÷0.0682×V 反总÷(500 ×V 样÷V 样总)÷T=0.0014×(ΔA+0.0432)V 样：加入样本体积：0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；V 反总：反应体系总体积，0.3mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；T：反应时间，60min。