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脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)测试盒/微量法
物品单位 价格 品牌
1200 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:100T/96S
  • 货号:LM-876452S
  • 发布日期: 2022-11-09
  • 更新日期: 2022-11-14
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876452S
用途范围 DHAR催化GSH还原DHA生成AsA,通过测定DHA减少速率,计算DHAR活性。
纯度 99%
CAS编号
规格 100T/96S
是否进口

脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)/微量法试剂盒
说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:
DHAR 存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA 和 GSSG,调控细胞AsA/DHA 比值,是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR 活性,可提高植物食品中 AsA 含量,进而提高植物食品的营养品质。


测定原理:

DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA,通过测定 DHA 减少速率,计算 DHAR 活性。
实验中所需仪器及设备:
研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、可调式移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 17.5mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1 瓶(棕色),4℃保存。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解。
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解。
粗酶液提取:
1. 按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);8000g 4℃离心 20min,取上清液置冰上混匀待测。
3. 血清等液体:直接测定。
DHAR 测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min,调节波长到 265nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。
3. 在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μL 试剂三、20μL 试剂四和 140μL 试剂二, 加 20μL 上清液迅速混匀后于 265nm 比色,记录 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2,△A=A2-A1。
DHAR 活性计算公式:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T= 92×△A ÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义:25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 92×△A ÷W
(3). 按细胞数量计算
活性单位定义:25℃中每 104个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 92×△A ÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样÷T= 92×△A
ε :AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol /cm;106:摩尔分子换算成微摩尔分子;d:比色杯光径,1cm;V 反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4 L;V 样:反应体系中加入上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL;W :样品质量;T:反应时间,2 min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T= 184×△A ÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义:25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 184×△A ÷W
(3). 按细胞数量计算
活性单位定义:25℃中每 104个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 184×△A ÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样÷T= 184×△A
ε :AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol /cm;106:摩尔分子换算成微摩尔分子;d:96 孔板光径,0.5 cm;V 反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4 L;V 样:反应体系中加入上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL;W :样品质量;T:反应时间,2 min。
注意事项:
临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存,3 天内使用完。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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