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单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测试盒/微量法
物品单位 价格 品牌
1600 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:100T/96S
  • 货号:LM-876454S
  • 发布日期: 2022-11-09
  • 更新日期: 2022-11-09
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876454S
用途范围 MDHAR 催化 NADH 还原MDHA 生成 AsA和NAD+,NADH在340 nm有特征吸收峰,但是NAD+没有。通过测定340 nm光吸收下降速率,来计算出MDHAR活性。
纯度 99%
CAS编号
规格 100T/96S
是否进口

单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)活性测定试剂盒说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:
MDHAR 催化 MDHA 还原生成 AsA,在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。


测定原理:

MDHAR 催化 NADH 还原 MDHA 生成 AsA 和 NAD+,NADH 在 340 nm 有特征吸收峰,但是 NAD+没有。通过测定 340 nm 光吸收下降速率,来计算出 MDHAR 活性。
实验中所需仪器及设备:
研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪和双蒸水
试剂组成和配置:
试剂一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 20mL×1 瓶,室温保存。
试剂三:粉剂×1 瓶(棕色),4℃保存。临用前加入 3 mL 蒸馏水充分溶解。
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解。
试剂五:液体 15μL×1 瓶,4℃保存。临用前加 3 mL 试剂二充分溶解。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
2. . 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);8000g ,4℃离心 20min,取上清液置冰上混匀待测。
3. 血清等液体:直接测定。
MDHAR 测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。
3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 试剂三、20μL 试剂四、20μL 试剂五和 120μL 试剂二, 加入 20μL 上清液,迅速混匀后于 340nm 比色,记录 30s 和 150s 的吸光值 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2,A=A1-A2。
MDHAR 活性计算公式:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
MDHAR 活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷(Cpr×V 样)÷T= 804×△A ÷Cpr
(2). 按样本质量计算
MDHAR 活性单位定义:25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1U。
MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 804×△A ÷W
(3)按细胞数量计算
MDHAR 活性单位定义:25℃中每 104个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 804×△A ÷ 细胞数量
(4)按液体体积计算
MDHAR 活性单位定义:25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样)÷T= 804×△A
ε:NADH 摩尔消光系数,6220 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4L;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒;W :样品质量;T:反应时间,2min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:
(1). 按蛋白浓度计算
MDHAR 活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷(Cpr×V 样)÷T= 1608×△A ÷Cpr
(2). 按样本质量计算
MDHAR 活性单位定义:25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1U。
MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 1608×△A ÷W
(3)按细胞数量计算
MDHAR 活性单位定义:25℃中每 104个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 1608×△A ÷ 细胞数量
(4)按液体体积计算
MDHAR 活性单位定义:25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样)÷T=1608×△A
ε:NADH 摩尔消光系数,6220 L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4L;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒;W :样品质量;T:反应时间,2min。
注意事项:
临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存,3 天内使用完。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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