硫氧还蛋白氧化还原酶（thioredoxin reductase, TrxR）试剂盒说明

测定意义：
TrxR 是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似，催化 GSSG 还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。

测定原理：

TrxR 催化 NADPH 还原 DTNB 生成 TNB 和 NADP+，TNB 在 412 nm 有特征吸收峰，通过测定 412nm 波长处 TNB 的增加速率，即可计算 TrxR 活性。
 
自备仪器和用品： 
低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸馏水。
 
试剂组成和配制： 
试剂一：液体 120mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 2mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。
 
粗酶液提取： 
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
TrxR 测定操作： 
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 412nm，用蒸馏水调零。
2. 试剂一在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）预热 30min。
3. 空白管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，加入 20μL 试剂二，20μL 试剂三，160μL 试剂一，迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 和 310 s 吸光度，记为 A1 和 A2。△A 空白管=A2-A1。
4. 测定管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，加入 20μL 试剂二，20μL 试剂三，140μL 试剂一，20μL 上清液，迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 和 310 s 吸光度，记为 A3 和 A4。△A 测定管=A4-A3。
注意：空白管只需测定一次。

TrxR 活性计算公式： 
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T= 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样本每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR（nmol/min /g 鲜重）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每 104个细胞每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR（nmol/min/104 cell）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷ 细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR（nmol/min /mL）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T= 147×（△A 测定管-△A 空白管）
ε：TNB 在 412nm 处的微摩尔消光系数，0.0136 L/μ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间（min），5min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T= 294×（△A 测定管-△A 空白管）÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样本每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR（nmol/min /g 鲜重）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 294×（△A 测定管-△A 空白管）÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每 104个细胞每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR（nmol/min/104 cell）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 294×（△A 测定管-△A 空白管）÷ 细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR（nmol/min /mL）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T= 294×（△A 测定管-△A 空白管）
ε：TNB 在 412nm 处的微摩尔消光系数，0.0136 L/μ mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W ：样品质量；V 样： 加入反应体系中上清液体积（mL），20μL

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