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NAD苹果酸酶(NAD-ME)测试盒/微量法
物品单位 价格 品牌
568 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:100管/96样
  • 货号:LM-876421S
  • 发布日期: 2022-11-09
  • 更新日期: 2022-11-14
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876421S
用途范围 NAD-ME催化NAD+还原成NADH,在340nm下测定NADH增加速率。
纯度 99%
CAS编号
规格 100管/96样
是否进口

NAD-苹果酸酶(Malic enzyme ,NAD-ME)试剂盒说明书

注 意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:

ME 广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中,尤其在植物组织中活性较高。ME 催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应,产生丙酮酸和 CO2,以及伴随 NAD(P)+的还原反应,是苹果酸代谢的关键酶。ME 活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物 ME 活性测定较多,已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同,可将 ME 分为 NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。

测定原理:

NAD-ME 催化 NAD+还原成 NADH,在 340nm 下测定 NADH 增加速率。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存。;
试剂一:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体 10mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃保存;

样本的前处理:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 检测工作液的配制:用时在试剂三中加入 15mL 试剂一和 1mL 蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
3、 测定前将检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、55μL 试剂二和 160μL 工作液,混匀后立即记录 340nm处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。
注意:如果 ΔA<0.005,可将反应时间延长到 2 分钟或 5 分钟。
NAD-ME 活性计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T = 3617×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T =7.234×ΔAV 反总:反应体系总体积,2.25×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b . 用 96 孔板测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 样) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T = 7234×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×500) ÷T =14.468×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2.25×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量;500:细菌或细胞总数,500 万。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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