胞浆异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）试剂盒说明书

注 意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
ICDHc（EC 1.1.1.42）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸，同时还原 NADP+生成 NADPH。ICDHc 是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种 NADPH 重要来源，在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。

测定原理： 

利用 ICDHc 催化 NADP+还原成 NADPH 反应，在 340 nm 下测定 NADPH 浓度的增加。
所需的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
 
试剂的组成和配制： 
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 19 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
 
样本的前处理： 
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。
 
测定步骤： 
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解；在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂一，混匀后立即记录 340nm 处 20s 后吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
 
注意事项： 
1、 若 A2-A1 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，使 A2-A1 小于 0.5，可提高检测灵敏度。计算公式中乘以2、 若 A2-A1 小于 0.005，可延长反应时间到 5min 或 10min。
ICDHc 活力单位的计算： 
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）ICDHc 活力的计算:
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=1608×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 ICDHc 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1608×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min/104）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=3.216×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）ICDHc 活力的计算：
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=3216×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 ICDHc 活力的计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=3216×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min/104）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=6.432×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，
0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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