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辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒/分光光度法
物品单位 价格 品牌
453 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:50管/24样
  • 货号:LM-876433S
  • 发布日期: 2022-11-09
  • 更新日期: 2022-11-09
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876433S
用途范围 分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm下检测吸光值,从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+为NADPH,从而检测NADP+含量。
纯度 99%
CAS编号
规格 50管/24样
是否进口

辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒说明书

注 意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP(NADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理: 

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm 下检测吸光值,从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为 NADPH,从而检测 NADP+含量。
所需的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
酸性提取液:50mL×1 瓶,4℃保存;
碱性提取液:50mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 15 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 支,-20 ℃保存,用时加入 4mL 蒸馏水,混匀;用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存,用时加入 4mL 蒸馏水,混匀;用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂四:粉剂×1 支,4 ℃保存,用时加入 4mL 蒸馏水,混匀;用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂五:液体 1.8mL×1 支,4 ℃保存;

试剂六:液体 30mL×1 瓶,4 ℃保存;
试剂七:液体 50mL×1 瓶,4 ℃保存。
NADP+和 NADPH 的提取:
1 血清(浆)中 NADP+和 NADPH 的提取
NADP+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADPH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2 组织中 NADP+和 NADPH 的提取:
NADP+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADPH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取:
NADP+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
NADPH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。
2、加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样):
试剂名称(μL) 对照管 测定管
样本 50 50
试剂一 250 250
试剂二 75 75
试剂三 75 75
试剂四 75 75
试剂五 35 35
试剂六 500 混匀,室温避光静置 20min
试剂六 500充分混匀,静置 5min 后,20000g,25℃离心 5min,弃上清,沉淀中加入:
试剂七 1000 1000混匀,570nm 下比色,读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2,计算△A=A2-A1。
注意事项:
1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NADP+测定中△A(A2-A1)≤0.0144,NADPH 测定中△A(A2-A1)≤0.0259,说明样本中辅酶含量较低,已低于检测限,可做如下调整:(1)将测定管避光静置时间 20min 延长到 60min;(2)在提取阶段增加取样量,即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 50 管保证测 24 个 NADP+或 NADPH。
NADP+和 NADPH 含量的计算:
(一)NADP+含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.197x + 0.0144,R2 = 0.9998;其中 y 为△A,x 为 NADP+浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.0144)÷0.197×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 101.5×(△A -0.0144)
2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADP+ (nmol/mg prot)=[(△A -0.0144)÷0.197×V1) ]÷(V1×Cpr)= 5.1×(△A -0.0144)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADP+ (nmol/g 鲜重)= [(△A -0.0144)÷0.197×V1)] ÷(W×V1÷V2)=10.2×(△A -0.0144)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADP+ (nmol/104 cell)=[(△A -0.0144)÷0.197×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.02×(△A -0.0144)
(二)NADPH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 1.2396x + 0.0259,R2 = 0.9977;其中 y 为△A,x 为 NADPH 浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/mL)= [(△A -0.0259)÷1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 16.1× (△A -0.0259)
2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot)=[ (△A -0.0259)÷1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)= 0.8× (△A -0.0259)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重)=[(△A -0.0259)÷1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)=1.6× (△A -0.0259)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/104 cell)=[(△A -0.0259)÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259)
V1:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
注意: 检测限为 0.01nmol/mL 或 0.01nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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