辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒说明书

注 意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP（NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理：
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm 下检测吸光值，从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为 NADPH，从而检测 NADP+含量。

所需的仪器和用品：
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；
碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 支，-20 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4 ℃保存一周；
试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4℃保存一周；
试剂四：粉剂×1 支，4 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4℃保存一周；
试剂五：液体 3.6mL×1 支，4 ℃保存；
试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；
试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。
NADP+和 NADPH 的提取：
1 血清（浆）中 NADP+和 NADPH 的提取

NADP+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL血清（浆），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADPH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2 组织中 NADP+和 NADPH 的提取：

NADP+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g 组织，加入1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADPH 的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g 组织，加入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取：
NADP+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：酸性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
NADPH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。
2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样）：

NADP+和 NADPH 含量的计算：
（一）NADP+含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.0985x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中 y 为△A，x 为 NADP+浓度 nmol/mL
1、血清（浆）中 NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144）
2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADP+(nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144）÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADP+(nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144）÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADP+(nmol/104 cell）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144）
（二）NADPH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.6198x + 0.0259，R2 = 0.9977；其中 y 为△A，x 为 NADPH 浓度 nmol/mL
1、血清（浆）中 NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259）
2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259）÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259）÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/104 cell）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259）
V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：
0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
注 意： 检测限为 0.01nmol/mL 或 0.01nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。