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辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒/微量法
物品单位 价格 品牌
970 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:100管/48样
  • 货号:LM-877322S
  • 发布日期: 2022-11-09
  • 更新日期: 2022-11-09
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-877322S
用途范围 分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm下检测吸光值,从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+为NADPH,从而检测NADP+含量。
纯度 99%
CAS编号
规格 100管/48样
是否进口

辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒说明书

注 意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP(NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理:
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm 下检测吸光值,从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为 NADPH,从而检测 NADP+含量。

所需的仪器和用品:
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:
酸性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
碱性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 支,-20 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4 ℃保存一周;
试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4℃保存一周;
试剂四:粉剂×1 支,4 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4℃保存一周;
试剂五:液体 3.6mL×1 支,4 ℃保存;
试剂六:液体 30mL×1 瓶,4 ℃保存;
试剂七:液体 50mL×1 瓶,4 ℃保存。
NADP+和 NADPH 的提取:
1 血清(浆)中 NADP+和 NADPH 的提取

NADP+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADPH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2 组织中 NADP+和 NADPH 的提取:


NADP+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADPH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取:
NADP+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
NADPH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。
2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样):

2022110911574222969

NADP+和 NADPH 含量的计算:
(一)NADP+含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.0985x + 0.0144,R2 = 0.9998;其中 y 为△A,x 为 NADP+浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144)
2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADP+(nmol/mg prot)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADP+(nmol/g 鲜重)= [(△A -0.0144)÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADP+(nmol/104 cell)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144)
(二)NADPH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.6198x + 0.0259,R2 = 0.9977;其中 y 为△A,x 为 NADPH 浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/mL)= [(△A -0.0259)÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259)
2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot)=[ (△A -0.0259)÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/104 cell)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259)
V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:
0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
注 意: 检测限为 0.01nmol/mL 或 0.01nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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